La actividad del Laboratorio de Reproducción Humana Asistida (LRHA) abarca una gran cantidad de procedimientos que han ido evolucionando con el transcurso de los años. En nuestro país el Grupo de Interés de Calidad de ASEBIR publicó en 2007 (de los Santos et al., 2007) un documento de consenso sobre indicadores de calidad en el LRHA a partir del cual se desarrollaron estándares para esos indicadores. En 2013, fueron incorporados en la UNE179007 (UNE179007:2013) y publicados como cuadernillo en 2016 (Grupo de Interés de Calidad ASEBIR, 2016). En 2011 tuvo lugar el Consenso de Estambul (Alpha Scientists in Reproductive Medicine, 2011), donde un grupo de expertos revisaba la evaluación embrionaria, en 2012 expertos de Alpha publicaron indicadores de calidad relacionados con criopreservación (Alpha Scientists in Reproductive Medicine, 2012). En 2017 un comité de expertos de Alpha y ESHRE se reunieron en Viena y publicaron un listado de indicadores de calidad bajo el nombre de Consenso de Viena (ESHRE Special Interest Group of Embryology and Alpha Scientists in Reproductive Medicine, 2017). Para continuar con la búsqueda de la excelencia en los LRHA, recientemente han sido publicadas las recomendaciones del Consenso de El Cairo (CC) (Cairo Consensus Group, 2020) para establecer los puntos más importantes en el cultivo de embriones en el LRHA, basados en el estado del arte.

El Consenso de El Cairo resulta de la reunión de expertos que tuvo lugar en 2018 y en ellas se describen más de 50 puntos a tener en cuenta en el laboratorio. La gran cantidad de factores a considerar, hace que el CC se resuma en que “hay una sola cosa que es realmente importante en un laboratorio de FIV: todo”

El CC reflexiona sobre el hecho de que el éxito del cultivo embrionario está en replicar las condiciones del ambiente del tracto reproductivo femenino a la perfección, sin embargo, esta tarea es tan irreal, que nuestro éxito real se debe basar en conseguir unas condiciones de cultivo que hagan que el embrión tenga el mismo potencial de implantación que el que tendría si se desarrollara in vivo.

CULTIVO EMBRIONARIO

Para el cultivo embrionario, se ha llegado a la conclusión de que los requerimientos básicos serían: la utilización de medio de cultivo completo comercial (que contenga los 20 aminoácidos), la atención a todos los factores de laboratorio y clínicos (fungibles, aparatos, procedimientos, etc), el cultivo embrionario a baja concentración de oxígeno y con bajos o indetectables niveles de VOCs, el desarrollo in vitro hasta blastocisto, la transferencia diferida de blastocistos (con el fin de evitar los efectos adversos sobre el ambiente uterino de estrógenos y progesterona) y, por último, de manera opcional, la transferencia única de blastocistos euploides criopreservados.

Parece claro que mantener una correcta temperatura en el laboratorio tanto durante el manejo como durante el cultivo es fundamental, sin embargo, no se ha llegado a establecer cuál es la temperatura ideal. Lo que sí se ha consensuado es que las fluctuaciones de temperatura de los aparatos del laboratorio deben ser mínimas y que una temperatura ligeramente baja puede ser más segura que una temperatura más alta para los embriones. Las medidas de temperatura de los equipos deben realizarse a diario, antes de comenzar a usarlos.

Se recomienda el uso de humidificación en el cultivo embrionario, ya que se ha demostrado un mejor desarrollo embrionario y mejores tasas de embarazo evolutivo cuando se cultiva en condiciones de humedad frente al cultivo “en seco”. Además, el uso de aceite no es suficiente para evitar los cambios en la osmolaridad del medio, aunque estos cambios se podrían atenuar con una renovación del medio cada 48h.

En cuanto a los gases en la incubación, está establecido que el pH en el medio de cultivo se debe mantener entre 7.2 y 7.3. Aunque el control del pH en el medio es complejo y resulta difícil medirlo con exactitud, los expertos indican que se deben validar los incubadores antes del uso para asegurar que se mantiene el pH correcto en el medio de cultivo y que se debe mantener el O2 al 5%, ya que está demostrado un mejor desarrollo de los embriones y mayores tasas de llegada a blastocisto que en cultivo a niveles atmosféricos de O2.

PUESTOS DE TRABAJO

Se recomienda el uso de cabinas de flujo especiales para FIV, ya que presentan ciertas mejoras necesarias en el laboratorio de FIV sobre las cabinas de flujo laminar vertical convencionales. A pesar de estas adaptaciones, este tipo de cabinas aún presentan ciertas carencias, por lo que se recomienda que una placa de cultivo no esté expuesta al aire durante más de 2 minutos, incluso usando una “campana” de CO2, ya que el pH del medio se vería alterado y podría someter a estrés a los embriones.

La preparación de las placas de cultivo se debe realizar en una cabina de flujo laminar vertical a temperatura ambiente, teniendo en cuenta que la rapidez en la preparación de las mismas es indispensable para evitar la evaporación del medio.

Los expertos del CC recalcan que el aspecto más importante a tener en cuenta en el laboratorio es el mantenimiento estable del ambiente de cultivo en los incubadores y nos destacan, en este sentido, que la recuperación de las condiciones de cultivo que tiene lugar después de una apertura del incubador conlleva una fase de equilibrado hasta llegar al “set-point” y una estabilización posterior. En este sentido, las aperturas de los incubadores deben mantenerse al mínimo, asegurándose de que haya el número de incubadores adecuado para el ritmo de trabajo y teniendo en cuenta que alguno de ellos se debe dedicar a un uso diferente al del cultivo (equilibrado de placas, preparación de muestras de semen, etc). Además, se recomienda el uso de filtros en línea para garantizar la limpieza de los gases que entran en el incubador. Se deberán monitorizar los resultados de cada incubador usando indicadores de calidad como el desarrollo hasta blastocisto y las tasas de embarazo.

Los expertos nos hablan de dos grandes principios en el manejo de los incubadores: el mantenimiento preventivo  (al menos una vez al año, aprovechando para limpiar y esterilizar todos los componentes) y las operaciones de mantenimiento diario (implementación de un programa de control de calidad, minimización de las aperturas y estabilidad del suministro de electricidad). Para el control de calidad interno deberemos establecer los ajustes y los intervalos de tolerancia de los mismos para cada sistema de cultivo, además de las frecuencias mínimas de medida de los mismos. En la guía, los expertos recomiendan que las variables críticas (temperatura, CO2 y O2) se midan diariamente y el pH mínimo semanalmente.

En cuanto al micromanipulador, en la guía se recalca la necesidad de mantener las condiciones de cultivo estables para gametos y embriones, para lo cual, se deberá procurar: mantener una temperatura óptima y estable, limitar la exposición a la luz de gametos y embriones, reducir las vibraciones para evitar el daño a las células y mantener la osmolaridad y pH correctos. Los expertos nos advierten de la importancia de prevenir potenciales problemas en el laboratorio, como un cambio inesperado de temperatura, por lo que debemos tener siempre en mente los riesgos en el laboratorio.

Existen numerosas publicaciones que apoyan el hecho de dejar más de 2h entre la punción y la denudación de los ovocitos y, aunque la información clínica es escasa, parece que una exposición prolongada de los ovocitos a la hialuronidasa puede afectarles negativamente.

Para la realización de la ICSI, en general se prefiere el sistema de microgotas bajo aceite. Los resultados parecen mejorar cuando se realiza de manera rápida y con un número limitado de ovocitos, por lo que los expertos recomiendan comprobar la visualización de espermatozoides, ovocitos y pipetas,  la alineación de las pipetas y la succión de las mismas antes de comenzar la ICSI. Además, se debe tener en cuenta que la exposición prolongada de los gametos al PVP se ha asociado con daño ultraestructural y efectos en la membrana de los espermatozoides y con retraso en las oscilaciones de calcio y en la descondensación de la cromatina.

MANEJO DE GAMETOS Y EMBRIONES

Como ya se ha puntualizado, el mantenimiento de la temperatura es un punto crucial a la hora de manejar gametos y embriones fuera del incubador. Los expertos nos advierten en la guía que precalentar pipetas no tiene sentido, puesto que se ha demostrado que las puntas de las mismas no retienen el calor. Por la misma razón, mantener catéteres de transferencia en estufa no sería eficaz y, además, aumentaría mucho los compuestos volátiles en su interior. Por tanto, la recomendación de los expertos es que tengamos en cuenta esta pérdida de temperatura tan rápida a la hora de trabajar, para intentar minimizarla lo más posible.

Para la recuperación de los ovocitos en la punción folicular, es esencial el uso de bloques calefactados para los tubos. Se ha observado que durante el paso de los cúmulos por la aguja y los conductos hasta el tubo, se pierden unos 2ºC. Aumentar la velocidad de aspiración para que la pérdida de temperatura sea menor sería contraproducente y se dañarían los complejos cúmulo-corona-ovocito (COC), por lo que los expertos recomiendan poner 2ml de medio tamponado a 37ºC en los tubos de recolección para contrarrestar rápidamente esta pérdida de temperatura. También se recomienda sacar los COC rápidamente a las placas de cultivo y no mantenerlos en la pipeta mientras se buscan otros, además de recortar los cúmulos que presentan sangre infiltrada, ya que esto podría afectar al desarrollo embrionario posterior.

En cuanto a la preparación de las muestras de semen, los expertos nos recuerdan que se debe minimizar el tiempo de exposición de los espermatozoides al plasma seminal para evitar los efectos adversos que produce sobre la capacidad de fertilización de los espermatozoides. Además, se recomienda la preparación de los espermatozoides para ICSI a temperatura ambiente para minimizar la generación de especies reactivas de oxígeno. Cada laboratorio deberá definir bien sus protocolos en cuanto al control de la temperatura y el pH en función del tipo de medio y la técnica que se use para la preparación de las muestras.

En la vitrificación, los pasos más delicados son el cambio de la placa de cultivo al medio al primer medio de vitrificación y el de la solución “warming” a la placa de cultivo. Se ha sugerido, para el primer paso, empezar a 37ºC en el primer medio y dejar que alcance la temperatura ambiente antes de vitrificar y, para el último paso de la desvitrificación, empezar a temperatura ambiente e ir calentando a 37ºC antes de devolver los embriones al cultivo

EVALUACIÓN DE GAMETOS Y EMBRIONES

La evaluación del semen debe incluir, como mínimo, volumen, movilidad, recuento y morfología de la muestra licuada.

Para la evaluación de ovocitos y embriones, se deben procurar realizar los mínimos pasos posibles para reducir los riesgos de daño, minimizando también el tiempo de exposición al ambiente y a la luz (evitando luces de baja longitud de onda). Si se usan medios secuenciales, el cambio de los mismos se hará coincidir con la evaluación de los embriones para minimizar el tiempo fuera del incubador.

La evaluación de ovocitos y embriones la deberá realizar personal entrenado y cualificado. Los embriólogos deben participar en controles de calidad internos y externos.

La evaluación de embriones en día 2/3 debe incluir: número de células, tamaño y simetría, fragmentación, granulosidad, vacuolas y estado nuclear. En el estadío de blastocisto se deberá evaluar: expansión, tamaño del blastocele y morfología de la masa celular interna y del trofoectodermo.

MEDIO DE CULTIVO

En cuanto a los tampones en el medio de cultivo, el consenso indica que son imprescindibles para mantener el pH adecuado tanto dentro como fuera del incubador, pero se debe evitar la exposición prolongada a algunos de ellos, como es el caso del HEPES. El uso simultáneo de diferentes tampones podría permitir el mantenimiento adecuado del pH evitándose los posibles efectos adversos de un solo tampón a mayor concentración.

No existe acuerdo sobre la composición exacta que deben tener los medios de cultivo, sin embargo, si hay consenso sobre algunos detalles como:

• Los medios complejos deben contener un fuerte complemento de aminoácidos esenciales y no esenciales, así como carbohidratos.
• Los medios deben contener antibiótico.
• Todos los medios de cultivo deben contener proteínas (generalmente, albúmina). El consenso propone que la industria use los suplementos proteicos mejor estudiados, preferiblemente recombinantes (HSA recombinante).
• El suero humano no se debe usar como suplemento en cultivo embrionario.
• El rojo fenol no es necesario ni beneficioso en el medio de cultivo.

El grupo de expertos señala la importancia del correcto almacenaje y mantenimiento de la cadena de frío de los medios de cultivo. En este sentido, se aconseja mantener la temperatura de refrigeración acorde con las indicaciones del fabricante (descartar medios si se han congelado), evitar la exposición de los medios a la luz, mantener  a la vista las fechas de caducidad y las condiciones de almacenaje de cada producto, usar los productos por orden de lote, no usar nunca productos caducados y no abrir varias veces los botes de medio para un uso posterior. Se recomienda usar neveras especiales para laboratorio con control de temperatura independiente

EQUIPAMIENTO DE LABORATORIO

Los expertos nos indican que se deberán realizar controles de manera continua de aquellos parámetros críticos que afectan a los equipos y la infraestructura del laboratorio (niveles de VOCs, temperatura, humedad, pH, O2, CO2).

LISTADO DE SUGERENCIAS

Aunque el CC defiende que multitud de factores influyen en el cultivo embrionario, publica una tabla resumen con 20 puntos a tener en cuenta:

1.- La probabilidad de cada paciente para tener un niño sano es el resultado más importante. La tasa acumulada de nacido vivo por paciente o por ciclo iniciado y otros parámetros similares deben ser monitorizados. Aún faltan evidencias de nivel alto.

2.- La evaluación de gametos y embriones debe basarse en opiniones de expertos o profesionales, revisiones, publicaciones y recomendaciones basadas en la evidencia.

3.- Las condiciones físico-químicas deben ser mantenidas durante la evaluación, pero falta evidencia para establecer el tiempo y la frecuencia óptimos.

4.- La evaluación del cultivo embrionario debe incluir la viabilidad embrionaria (desarrollo in vivo) después de la transferencia. Las medidas apropiadas son la tasa de implantación, niños nacidos vivos por embrión transferido y tasa de pérdida embrionaria y fetal.

5.- La validación de la temperatura es crítica para cada paso en la fecundación in vitro. La evidencia sostiene el mantenimiento de 37º C durante todos los aspectos del cultivo, pero tanto los incubadores con ambiente humidificado como los no humidificados pueden ser efectivos dependiendo de las condiciones.

6.- La medición de pH y concentración de CO2 puede ser un control de calidad efectivo. La evidencia apoya el cultivo de embriones en condiciones de atmósfera con baja concentración de O2.

7.- La validación de la micromanipulación debe incluir un mapeo de la temperatura de la placa para determinar el periodo máximo en el que el ovocito se mantiene a 37º C y se debe elegir el ajuste de luz más bajo.

8.- Es crítico que el estrés mecánico, así como los cambios de temperatura y pH, sean minimizados durante todos los procedimientos de evaluación y pipeteo.

9.- Los programas validados de gestión de calidad para la monitorización rutinaria del funcionamiento de los incubadores deben incluir valoraciones diarias de temperatura, CO2, O2 y humedad. Se requieren unos objetivos preestablecidos con las tolerancias (límites de control y de peligro) para cada variable como puntos de referencia.

10.- El suministro de gases del incubador debe ser filtrado para eliminar partículas y contaminantes. Para incubadores con suministro de gases premezclado, los niveles de gas individual en la mezcla deben ser verificados y los niveles de CO2 licuado deben ser monitorizados.

11.- Determinados tampones (por ejemplo, HEPES y MOPS) parecen ser seguros para estabilizar el pH externo fuera del incubador, pero las consecuencias de la exposición prolongada son inciertas.

12.- Los medios de cultivo de fabricación comercial desarrollados para tratamientos de reproducción humana asistida deben ser usados con el suplemento de proteína recomendada por los fabricantes.

13.- Actualmente la evidencia es insuficiente para apoyar la adición de componentes bioactivos, como factores de crecimiento, al medio de cultivo de gametos y embriones. Se requieren más estudios de seguridad y eficacia antes de su inclusión rutinaria.

14.- Se requieren Procedimientos Operativos Estándar para verificar la aceptabilidad para la recepción y el uso de todos los materiales de contacto, de acuerdo con las buenas prácticas y las regulaciones locales. Esto incluye el mantenimiento permanente de registros de certificados de análisis y números de lote. El laboratorio debe monitorizar el funcionamiento de estos materiales.

15.- Tanto los medios secuenciales como los medios únicos son efectivos para el desarrollo embrionaria y obteniéndose con ambos buenos resultados. La evidencia actual es limitada e insuficiente para demostrar que uno de los dos sistemas de cultivo es superior al otro.

16.- El medio de cultivo debe ser mantenido y monitorizado bajo las condiciones de almacenamiento recomendadas por el fabricante. Se debe monitorizar apropiadamente el mantenimiento y las neveras de almacenaje.

17.- Es deseable, y puede ser obligatorio en ciertos países, la monitorización continua e independiente de los parámetros críticos de los equipos y la infraestructura del laboratorio.

18.- Los lotes de los medios de cultivo pueden ser validados utilizando indicadores de calidad aceptados como los del Consenso de Viena.

19.- Los espermatozoides para técnicas de reproducción asistida deben ser separados eficientemente del ambiente del plasma seminal tan pronto como sea posible después de la eyaculación.

20.- La preparación de los espermatozoides para ICSI debe ser llevada a cabo a temperatura ambiente para minimizar la generación de especies reactivas de O2. para veriientos Operativos Estaativos Este su inclusinto, al medio de cultivo de gametos y embriones. se  del incubador, pero l