INTRODUCCIÓN

El objetivo principal de la criopreservación de espermatozoides es mantener su viabilidad y funcionalidad a bajas temperaturas durante largos periodos de tiempo. Las células criopreservadas se almacenan a -196ºC en nitrógeno líquido. A esta temperatura no existen fenómenos ni de difusión ni energía térmica suficiente para llevar a cabo reacciones químicas. Por tanto, las dificultades de la congelación no derivan de la permanencia a bajas temperaturas sino de los procesos de enfriamiento y calentamiento.

Durante estos procesos las células se encuentran en suspensión en una solución acuosa. Dicha solución tendrá unas propiedades coligativas que dependen fundamentalmente del número de moléculas que hay en ella y no de la naturaleza de estas. Así, al añadir un soluto a una disolución disminuye el punto de congelación (punto crioscópico) y la presión de vapor, y aumenta la presión osmótica y el punto de ebullición. La ósmosis es el movimiento del agua desde soluciones con baja concentración de soluto hasta soluciones con alta concentración de soluto y la presión osmótica es la presión hidrostática que se genera a través de una membrana semipermeable con un gradiente de concentración. Estas propiedades deberemos tenerlas presentes cuando al disminuir la temperatura durante el proceso de congelación empiece a formarse hielo en el medio extracelular, pues el agua que forma parte del hielo no contiene los solutos que tenía disueltos, aumentando la concentración de estos en el medio extracelular (hiperosmótico) y modificando las propiedades coligativas de este.

Durante estos procesos las células se comportan como osmómetros, variando su volumen en respuesta a los cambios osmóticos extracelulares, así las células pierden o captan agua según se expongan a medios extracelulares híper o hipo osmóticos, respectivamente; los movimientos de agua y crioprotectores a través de la membrana celular durante la criopreservación se rigen por diversos parámetros biofísicos que deben ser definidos para cada tipo celular a diferentes temperaturas, y en definitiva serán los responsables del daño celular.

CONCEPTOS GENERALES DEL TRASNPORTE A TRAVÉS DE LAS MEMBRANAS DURANTE LA CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN

A modo de ejemplo, podemos considerar una célula como una “bolsa” rellena de una solución salina sumergida en un medio de congelación (medio extracelular). El envoltorio de la bolsa, es decir, la membrana celular tendrá propiedades de membrana semipermeable.

Las dos características principales que van a definir el comportamiento de la membrana son: el tamaño y la permeabilidad.

TAMAÑO

Es el área de membrana disponible para intercambiar agua con el medio exterior.

PERMEABILIDAD.

Este parámetro define la facilidad con la que el agua puede atravesar la membrana ante un gradiente de concentraciones. La permeabilidad de la membrana celular está regulada por una ley que refleja el hecho empírico de que cuanto menor es la temperatura del sistema, menor es la permeabilidad de la membrana. De esta manera la membrana celular pierde su carácter semipermeable para pasar a tener un carácter impermeable, por debajo de una cierta temperatura crítica. Cuando enfriamos el sistema por debajo de dicha temperatura crítica, el proceso de deshidratación se detiene, esto se traduce en un aumento de la probabilidad de formación de hielo intracelular. Experimentos de laboratorio muestran que la permeabilidad de la membrana celular, además de variar con la temperatura del sistema, también depende de la concentración de soluto en el medio extracelular.

El contenido de la “bolsa”, es decir, el medio intracelular estará constituido por dos regiones:

VOLUMEN OSMÓTICAMENTE INACTIVO

En esta región incluimos orgánulos internos de la célula, el núcleo celular, macromoléculas como por ejemplo proteínas, etc. Son partes internas de la célula que no van a intervenir en el proceso del transporte del agua. Se define como el agua que nunca dejará el interior celular en respuesta a un aumento de concentración de solutos en el espacio extracelular por estar asociado a las macromoléculas y estructuras intracelulares. Si una célula se deshidrata y reduce su tamaño más allá del volumen osmóticamente inactivo puede comprometerse la viabilidad de esta (Hipótesis de volumen mínimo de Meryman para explicar el daño celular durante la congelación) (Meryman, 1970).

VOLUMEN OSMÓTICAMENTE ACTIVO

En esta región incluimos la solución intracelular en la que están flotando los orgánulos internos, el núcleo, etc., y que sí puede abandonar la célula.

RESPUESTA CELULAR A LA CONGELACIÓN

SHOCK POR FRÍO Y DAÑO DE ENFRIAMIENTO (DESDE 37ºC A 0ºC)

El shock por frío (cold shock) es el daño celular debido a la sensibilidad frente a la velocidad de enfriamiento, y es causada por efectos de transición en la fase lipídica (Drobnis et al., 1993). El daño de enfriamiento (chilling injury) es el daño debido a la sensibilidad frente a una temperatura específica o un rango de temperaturas.

Los ácidos grasos pueden existir en un estado rígido ordenado (gel) o en uno más flexible y relativamente desordenado (fluido). La transición de un estado al otro se da en un rango de temperaturas, la media de la cual se conoce como temperatura de transición de fase (“melting temperature”, Tm). Esta temperatura de transición será mayor o menor dependiendo de la composición de los ácidos grasos de la membrana. La mayoría de las membranas de células eucariotas tienen su Tm entre los 0ºC y los 20ºC.

La transición de fase en una membrana plasmática no se da simultáneamente en todos sus fosfolípidos y por tanto se espera la coexistencia de dominios en estado fluido y dominios en estado gel durante la transición. Esta situación produce defectos en el empaquetamiento de las membranas y está asociado a una mayor permeabilidad de solutos a través de esta. Así, se ha demostrado que al alcanzar la temperatura de transición en una bicapa determinada, se produce la mayor pérdida de solutos a través de la membrana.

Además esta alteración causa alteraciones físicas de la membrana plasmática por la inducción de fallos en el empaquetamiento de lípidos, las alteraciones transitorias de la fase lipídica causan respuestas cinéticas no lineales en algunas enzimas, incluidas algunas ATPasas de membrana. Es probable que tales efectos sean en parte responsables del mal control de la concentración del calcio celular lo que es evidente a temperaturas por debajo de los 17 ºC (Bailey et al., 1994).

El choque térmico puede ser mitigado por agentes crioprotectores, la presencia de ciertos fosfolípidos (fosfatidil serina), una congelación lenta y pre acondicionamiento en un medio con un nivel elevado de sales. El espermatozoide humano parece afectarse poco por el shock por frio y daño por enfriamiento, probablemente gracias a la composición de su membrana (Holt, 2000).

FORMACIÓN DE HIELO (0ºC A <-132ºC)

La respuesta de las células al enfriamiento, depende del método de enfriamiento. En particular la velocidad de enfriamiento es el parámetro crítico que determina los resultados del protocolo de criopreservación. A continuación vamos a describir los procesos básicos que han sido observados, cuando se induce hielo en el medio extracelular, en función del perfil de enfriamiento aplicado.

La existencia de solutos en el agua produce un descenso del punto de congelación (punto crioscópico entre – 5ºC y -10ºC) y en consecuencia la cristalización del agua se produce a temperaturas menores a la del punto de congelación del agua pura (0ºC). Esto produce, al disminuir la temperatura, un sobreenfriamiento de la muestra (Mazur, 1977). En esta situación el comienzo del proceso de formación de hielo es de naturaleza aleatoria, y depende de la probabilidad de formación de un punto de nucleación, punto de inicio de un frente de cristales de hielo que es inversamente proporcional a la temperatura. Cuanto mayor sea la diferencia entre la temperatura a la que comienza a formarse hielo y la temperatura de cambio de fase, mayor será la velocidad de crecimiento de los cristales de hielo. En el peor de los casos, puede ocurrir que la temperatura a la que comienza a formarse hielo sea tan baja, que la velocidad de crecimiento de los cristales resulta explosiva. En estas condiciones los cristales de hielo actúan como lanzas que atraviesan las células, destruyéndolas por completo.

Para evitar este problema, en algunos protocolos, se induce la formación de hielo extracelular (nucleación o seeding), mediante un descenso brusco de temperatura (fig.1) para garantizar que cuando la temperatura del sistema sea la de cambio de fase, tengamos hielo. Existen numerosas maneras de inducir la formación de hielo. En el caso de muestras de células aisladas se toca la muestra con una aguja fría, a una temperatura inferior a la de cambio de fase. Además este descenso de temperatura inducido pretende evitar fluctuaciones de temperatura sobre las membranas celulares. Esto es debido a que al congelarse el medio de congelación se libera calor por la formación de cristales (calor latente de la fusión) que provoca un fuerte aumento en la temperatura y como consecuencia la temperatura de las células no disminuye en paralelo con la caída de la temperatura del dispositivo de congelación. De hecho, la temperatura de la muestra puede permanecer estática durante 2-3 min antes de reanudarse el enfriamiento. Varios estudios han demostrado que este período entre la formación de hielo y la reanudación de enfriamiento, el punto de congelación meseta, es perjudicial para la supervivencia celular (Fuller et al., 2004). En los protocolos habituales de congelación de semen no se realiza el “seeding” o nucleación inducida pues no se ha visto que mejoren las tasas de supervivencia, lo cual puede ser debido a que el espermatozoide humano contiene una matriz intracelular altamente viscosa gracias a la abundancia de proteínas y azucares. Su pequeño tamaño, hace que su contenido de agua sea bajo y su estructura compartimentalizada hace que la formación de pequeños cristales intracelulares no afecte a toda la célula sino a zonas aisladas.

La formación de hielo extracelular rompe el equilibrio isotónico por una única razón: el agua que forma parte del hielo no contiene los solutos que tenía disuelta cuando formaba parte de la disolución acuosa del medio extracelular. Por lo tanto, cuando comienza a formarse hielo fuera de las células, simultáneamente se está produciendo un aumento de la concentración de los solutos disueltos en el medio extracelular.

Mientras tanto, en el interior de las células no se ha producido cambio alguno. Debido a la naturaleza semipermeable de la membrana celular, este gradiente en la concentración de solutos entre el medio extra e intracelular origina una sobrepresión del lado de la disolución que tiene una concentración de solutos menor, que desencadena un flujo de disolvente puro desde la región menos concentrada hacia la región de mayor concentración. Esta sobrepresión se puede interpretar como la diferencia de presiones osmóticas que tienen las dos disoluciones.

Vemos por tanto que la formación de hielo extracelular, tiene como consecuencia la evacuación de agua desde el medio intracelular hacia el medio extracelular, en un proceso que llamaremos Deshidratación Celular.

En el espacio intracelular no tiene lugar la formación de hielo en estos momentos (<-10ºC) posiblemente por la barrera física que impone la membrana celular al proceso de nucleación y al crecimiento de los cristales de hielo. Además, la probabilidad de iniciar la nucleación en el medio intracelular es mucho menor que en el medio extracelular ya que la nucleación está directamente relacionada con el tamaño del compartimiento a congelar (Mazur, 1963).

Paradójicamente la formación de hielo extracelular, en principio podría evitar que se formase hielo dentro de la célula, ya que al aumentar la concentración de solutos en la región intracelular, el punto crioscópico disminuye. Por lo tanto podemos tener una solución intracelular líquida a temperaturas muy inferiores a los cero grados centígrados, que es aproximadamente el punto crioscópico (temperatura en que se produce el cambio de fase liquida a sólida) del medio intracelular original, cuando existía equilibrio isotónico natural. No obstante, esto no llega a ocurrir debido a que la velocidad con que la célula es capaz de evacuar agua es muy pequeña comparada con la velocidad con que disminuye la temperatura.

DESCONGELACIÓN

Durante la descongelación se reproducen los cambios osmóticos inversos a los descritos para la congelación. Así, cuando el agua congelada cambia de estado (sólido a líquido), la concentración de solutos en el medio extracelular se reduce progresivamente y la célula vuelve a hidratarse para compensar esta diferencia de concentraciones entre el exterior y el interior celular.

Generalmente se considera que para la recuperación de las células son necesarias tasas de recalentamiento rápidas. Esto se ha atribuido a la posibilidad de que pequeños cristales de hielo intracelular formados en algunas células durante la congelación podrían crecer durante un proceso lento de recalentamiento, produciéndose el concepto de congelación durante el calentamiento, también llamado recristalización. Sólo si el calentamiento es tan rápido como para evitar el crecimiento de los cristales de hielo este fenómeno puede evitarse (Rall et al., 1980).

LESIONES CRIOINDUCIDAS

Cuando la temperatura del medio alcanza los -132ºC, el agua no existe en estado líquido y los canales donde se encuentran las células se encuentran en un estado vítreo (con una alta viscosidad) y sin cristalización, un estado en el que los fenómenos de difusión de las reacciones bioquímicas no son posibles (Mazur, 1984) (Tabla 1). Por tanto parece claro que la formación de hielo extracelular no es la responsable del daño celular ya que las células criopreservadas se mantienen en dichos canales de solución no congelada mientras crecen los cristales de hielo en la solución extracelular superenfriada (Nei ,1978).

Por otra parte, observaciones experimentales muestran que cuando enfriamos muestras a altas velocidades, la supervivencia de las células al proceso de criopreservación disminuye conforme aumentamos la velocidad de enfriamiento. Y que cuando enfriamos muestras a muy bajas velocidades, la supervivencia de las células al proceso de criopreservación disminuye conforme disminuimos la velocidad de enfriamiento (Fig. 2). Cuando la supervivencia celular se dibuja en función de la velocidad de enfriamiento, el resultado produce una curva característica “forma de U invertida”(Fig. 3).

Para tratar de explicar este doble comportamiento de la supervivencia frente a las velocidades de enfriamiento, se ha propuesto una teoría denominada Hipótesis de los Dos Factores (Leibo, 1970). En ella se proponen dos mecanismos distintos como causa de los daños en las células, durante el protocolo de criopreservación (producción de hielo y deshidratación celular o estrés osmótico). Siendo clave para determinar la importancia de cada factor la velocidad de congelación (Fig.2).

FORMACIÓN DE HIELO INTRACELULAR

A partir de que se inicia la nucleación extracelular y la correspondiente deshidratación celular lo que suceda en el espacio intracelular depende básicamente de la velocidad de enfriamiento (Mazur, 1963; Nei et al., 1970). Si ésta es demasiado rápida, la célula puede no ser capaz de deshidratarse suficientemente rápido y al llegar a la temperatura de nucleación intracelular, el agua remanente se congela formando hielo intracelular. La manera en la que este hielo daña a la célula, no es del todo conocida, pero se piensa que es debido a una disfunción de origen mecánico de las propiedades de la membrana celular y de otras estructuras celulares suspendidas en su interior, como pueden ser orgánulos celulares o grandes macromoléculas de proteínas. Lo que sí se sabe es que cuanto mayor sea la cantidad de hielo formado dentro de la célula, menor es la esperanza de que la célula sobreviva.

Podríamos pensar, llegados a este punto, que un buen protocolo de criopreservación sería aquel en el que la velocidad de enfriamiento fuera tan lenta que apenas formásemos hielo, pues permitirá la salida de todo el agua intracelular. Sin embargo existe otro mecanismo que provoca daños celulares y que precisamente actúa cuando las velocidades de enfriamiento son muy reducidas, lo que hace inviable este protocolo que acabamos de proponer.

ESTRÉS OSMÓTICO

Este mecanismo, activo a bajas velocidades de enfriamiento, está relacionado con la deformación mecánica de la célula, debida a la reducción de tamaño originada por el proceso de deshidratación tan intenso, y a la prolongada exposición de la célula a elevadas concentraciones de electrolitos. Este mecanismo se conoce como “Efecto de Solución” ( Mazur et al., 1970) Existen básicamente dos teorías complementarias para explicar el fenómeno de estrés osmótico durante la criopreservación.

La primera (hipótesis de altas concentraciones de iones) achaca a las interacciones de las altas concentraciones de iones alcanzadas en el medio extracelular con las proteínas de membrana, lo que provocaría la desnaturalización de éstas mediante la formación de puentes de disulfuro entre aminoácidos (Lovelock, 1953; Karow, 1965).

La segunda hipótesis (hipótesis del volumen celular mínimo) relaciona el efecto de la deshidratación producida durante la concentración de solutos y la muerte celular con la vuelta a las condiciones isotónicas después de la congelación (choque osmótico) (Merryman, 1970). Se basa en que el volumen se reduce en relación al aumento de la osmolaridad extracelular, a medida que la célula pierde volumen por la pérdida de agua, la compresión del contenido citoplasmático aumenta la resistencia de la célula a seguir perdiendo volumen, y al excederse la resistencia física de la membrana se producirán lesiones irreversibles en su permeabilidad y pérdida de lípidos de la membrana celular. Esta pérdida afectaría a la integridad de la membrana plasmática que perdería su capacidad de expansión durante la rehidratación al volver a condiciones isotónicas.

En resumen, a velocidades de enfriamiento lentas el daño celular se produce por la elevada concentración de solutos en el medio extra celular y a elevadas velocidades de enfriamiento por la formación de hielo intracelular. Existe una velocidad de enfriamiento para cada célula en la cual estos dos daños son bajos denominándose, velocidad óptima de enfriamiento, alcanzándose un máximo en la probabilidad de supervivencia de las células a la criopreservación.

A pesar de que se ha comprobado la validez universal de la hipótesis de los Dos Factores en todas las células estudiadas, el protocolo de criopreservación que optimiza la supervivencia no es universal, es decir, cada tipo de célula requiere su propio protocolo optimizado, de acuerdo con sus propiedades biofísicas (Nijs et al., 2001).

RECRISTALIZACIÓN

El agua en estado líquido, al enfriarse va formando cristales y como hemos comentado esta formación no es homogénea, existiendo al mismo tiempo en estado líquido y sólido. El agua en estado líquido se va haciendo cada vez mas viscosa, hasta que alcanza los -132º C, en donde es tan viscosa que no puede convertirse en cristal, llamándose a esa fase estado vítreo.

Todos los materiales biológicos deben almacenarse por debajo de la temperatura de transición de fase del agua de líquido a estado vítreo (aproximadamente-132ºC) para poner fin a toda actividad biológica. A temperaturas superiores a -132ºC se reduce la longevidad celular a cuestión de semanas o meses, pues aun puede existir agua líquida y por lo tanto actividad celular.

La transición a estado vítreo de una solución acuosa congelada no ocurre repentinamente en -132ºC; sino que es un fenómeno progresivo entre esta temperatura y -90ºC. En una célula congelada a -196ºC que pasa a -80ºC, algunas moléculas de agua vuelven a estado líquido que pueden convertirse en cristales que provocan pequeños daños de recristalización. El problema es que los pequeños daños son acumulativos; y cada incidente de calentamiento que se produzca por encima de -132ºC (por Ej. El sacar un canastier del nitrógeno líquido para extraer otra pajuela) contribuirá a disminuir la supervivencia funcional de las células criopreservadas.

AGENTES CRIOPROTECTORES

Además de una adecuada velocidad de enfriamiento, para mejorar la viabilidad celular es necesario alterar el comportamiento físico-químico de las soluciones acuosas en las cuales tiene lugar la criopreservación, para ello se añaden al medio de congelación los agentes crioprotectores (CPA). Los CPA son sustancias muy hidrosolubles y de baja citotoxicidad que disminuyen el punto eutéctico de una solución determinada (temperatura mínima a la que una solución se encuentra en estado líquido). El descenso del punto eutéctico implica que se alcanzará una concentración dada de solutos a una temperatura menor, de forma que en el momento en el que se induce la nucleación en el espacio extracelular la célula estará más hidratada y el gradiente osmótico al que estará sometida será menor en el momento en que el espacio extracelular se congela. Los crioprotectores pueden clasificarse en agentes penetrantes y no penetrantes, de acuerdo a la permeabilidad a través de la membrana celular.

CPA PENETRANTES

Son sustancias de bajo peso molecular y permeables a través de la membrana, que protegen a la célula de las lesiones producidas por las congelaciones a velocidad lenta. Los más utilizados son: 1,2-Propanodiol (PROH), Dimetilsulfóxido (DMSO), Etilén-Glicol (EG), Glicerol. Todos estos compuestos tienen en común que sus moléculas son pequeñas, es decir, tienen un peso molecular relativamente bajo; así el glicerol tiene 92.09 de peso molecular, lo que le permite atravesar la membrana celular. Si bien la célula es permeable a estos agentes su permeabilidad nunca es de la misma magnitud que la del agua. Dentro de este grupo el glicerol es el más usado en la criopreservación espermática.

CPA NO PENETRANTES

Son sustancias de alto peso molecular, que son efectivas cuando se utilizan velocidades altas de congelación. El tamaño de estas moléculas es muy superior a las del grupo anterior. Así por ejemplo, el peso molecular de la sacarosa es 342. No son crioprotectores propiamente dichos, ya que no penetran en la célula sino que ejercen su acción crioprotectora promoviendo la rápida deshidratación celular y suelen usarse asociados a los agentes penetrantes. Los más utilizados son: Sacarosa, Glucosa, Dextrosa, Polivinilpirrolidona (PVP), Dextrano y Polietilen-glicol (PEG), (en congelación de semen humano las más usados son los dos primeros).

Dependiendo de la permeabilidad del crioprotector utilizado y de su citotoxicidad, la adición se realiza a distintas temperaturas. Los agentes crioprotectores pueden añadirse y extraerse en pasos, es decir aumentando o disminuyendo gradualmente la concentración de crioprotector en el medio, lo que reduce el stress osmótico sobre la célula a congelar; o bien añadirse (o extraerse) en un solo paso, lo que reduce el tiempo de exposición celular al crioprotector.

Existen dos formas diferentes de adicción o disminución gradual del CPA al medio. En la primera, la solución de CPA (en el caso de adición) o un medio de cultivo (en el caso de dilución) se añaden en distintos pasos pero con un “volumen fijo”. En la segunda, la adición de CPA o diluyente varían en volumen para producir cambios equilibrados en la molaridad del CPA. Esto ha sido denominado como “fixed molar step” (Gao et al., 1995; Gilmore et al., 1997).

Aunque células pequeñas (como espermatozoides) contienen muy poca agua, su cantidad corresponde en gran parte (45-75%) al volumen osmóticamente inactivo, y esto es lo que hace que se deshidrate muy poco en comparación con otras células. Los espermatozoides humanos se pueden hinchar sólo un 110% de su volumen isosmótico original mientras que pueden disminuir un 75% de su volumen y retener ≥90% de su motilidad original (Gao et al., 1995). Como vemos los espermatozoides toleran menos un fuerte hinchazón que un encogimiento, y es por eso que la eliminación del CPA tras la descongelación puede tener un efecto dramático sobre las tasas de supervivencia espermática.

Si la dilución del CPA se realiza en un solo paso, se obtiene un incremento del volumen espermático del 160 % y una pérdida de aproximadamente el 70% de la motilidad. Por el contrario, el máximo aumento del volumen de un célula utilizando una dilución “fixer molar step” nunca supera el límite superior del volumen celular y por consiguiente no tienen ningún efecto adverso sobre la supervivencia espermática. Además la adición de CPA también parece causar menor daño cuando se realiza gradualmente (Gilmore et al., 1997). Todo lo anterior obliga a cuidar al máximo el tiempo empleado en la adición de los medios de congelación al semen y la dilución con medio de cultivo tras descongelación, siendo necesario invertir varios minutos en ello según cada protocolo.

BENEFICIOS DE LOS CPA

A pesar de que el uso de estas sustancias en los protocolos de criopreservación es una práctica habitual, los mecanismos de protección no son del todo conocidos. Los mecanismos que con certeza se saben que actúan a favor de la supervivencia celular son mecanismos físicos:

-Dilución de los electrolitos: La alta concentración de los electrolitos en las últimas etapas de la deshidratación celular, fue una de las hipótesis de los mecanismos causantes de la muerte celular. Los CPA protegen a la célula de los efectos de los solutos. Este objetivo se logra porque las CPA diluyen la alta concentración de electrolitos. Este efecto es descrito por la “regla de fases”, que establece que en un sistema de dos fases, como agua líquida y hielo a una presión dada, la concentración total de soluto en la fase líquida es constante para una determinada temperatura. Así, como el agua se solidifica en hielo, la solución restante contendrá progresivamente mayores concentraciones de CPA y electrolitos. Como la concentración total de CPA y electrolitos debe ser constante, mayor es la concentración de CPA y menor es la concentración de electrolitos. Así, la CPA efectivamente diluye la concentración de electrolitos en la solución limitando así su toxicidad.

-Disminución de la concentración de agua: El otro mecanismo que causaba muerte celular era la formación de hielo intracelular. Al introducir en el medio más moléculas (de crioprotector), los cristales de hielo en crecimiento tienen una mayor dificultad para encontrar moléculas de agua y seguir así creciendo, reduciendo de esta manera el riesgo de muerte celular.

-Aumento de la viscosidad: Al añadir sustancias crioprotectoras al medio intracelular, la viscosidad de éste aumenta. Esto reduce la movilidad de las moléculas en su seno, por lo que la formación de cristales de hielo se ve menguada, aumentando de esta manera la probabilidad de supervivencia.

-Efecto coligativo: Al añadir un soluto (CPA) a un disolvente (medio de congelación) el punto crioscópico de la solución desciende, necesitándose una temperatura más baja para el cambio de fase. Por lo tanto, las células experimentarían menos estrés salino que si estuvieran bajo las mismas condiciones sin CPA. Este efecto ‘salt buffering’ podría impedir el establecimiento crítico de altas concentraciones de soluto en la fracción residual de congelación hasta que el sistema se enfría llegando a temperaturas muy bajas donde toda la actividad molecular es inhibida (Lovelock et al., 1954).

-Otros mecanismos de naturaleza bioquímica, se sospecha que son también causantes de la elevada tasa de supervivencia que se alcanza al añadir agentes crioprotectores. Tan sólo comentaremos a modo de ejemplo que ciertos agentes crioprotectores podrían estabilizar la membrana celular mediante interacciones electrostáticas con los fosfolípidos de ésta (Hammerstedt et al., 1990).

En resumen, los crioprotectores reducen la cantidad de hielo formado a una temperatura determinada y por tanto la concentración de soluto durante la congelación y así la deshidratación celular. Esta reducción en la deshidratación celular hará que la célula no llegue nunca al volumen celular mínimo durante el proceso de congelación.

ASPECTOS PERJUDICIALES DE LOS CPAS

A pesar de los bien conocidos efectos beneficiosos de los agentes crioprotectores, éstos pueden ser muy dañinos, especialmente cuando son empleados en altas concentraciones. Los principales efectos dañinos son dos:

-Toxicidad: Los agentes crioprotectores son sustancias químicas que en condiciones normales no se encuentran en el interior de las células. Por ello, cuando atraviesan la membrana celular y se difunden por el medio intracelular, lo que realmente estamos haciendo es envenenar a la célula (Fuller et al. 2004). Sin embargo como el metabolismo celular está muy ralentizado, la acción tóxica de los crioprotectores se ve muy disminuida, salvo que empleemos muy altas concentraciones a temperaturas relativamente altas (en el entorno de los 0ºC).

-Ósmosis: La adición de CPA ejerce per se un estrés osmótico sobre las células porque aumentan la osmolaridad del medio. Las células inicialmente se deshidratan para compensar la fuerza osmótica inducida por la presencia de los CPA y después se hidratan a la vez que el agua vuelve al interior celular junto con el CPA (permeable). Cuando el CPA permeable entra en la célula (lo hace más lentamente que el agua, debido a un mayor coeficiente de permeabilidad de la membrana al agua que al CPA), las células regresan a su volumen isotónico normal. Tras la eliminación del CPA permeable por dilución de la muestra tras la descongelación, el agua entra en las células rápidamente, debido al gradiente osmótico que se genera, y entonces el CPA sale de las células más lentamente; por lo tanto, las células se hinchan antes de alcanzar el equilibrio. Estos cambios en el volumen de la célula (contracción e hinchazón) pueden ser lo suficientemente grandes como para causar un daño celular irreversible. A la presión osmótica a partir de la cual se producen estos daños se le denomina “ límite de tolerancia osmótica”. Estos límites son únicos no sólo para cada tipo de celular, sino también para cada especie celular.

-Cambios en la permeabilidad al agua de la membrana plasmática: diferentes CPAs reducen la permeabilidad al agua en diversos grados, y así los espermatozoides se deshidratan más lentamente de lo esperado (Gilmore et al., 1995). El flujo de agua en la membrana es realizado por dos vías, por canales proteicos y a través de la bicapa lipídica. Por lo tanto, un CPA podría afectar la permeabilidad de la membrana en al menos tres maneras. Primero, el CPA podría modificar la bicapa lipídica, causando un cambio en su permeabilidad. Segundo, una modificación de la bicapa lipídica podría afectar indirectamente a la actividad transportadora de las proteínas de membrana. Tercera, el CPA podría interferir directamente con la función de las proteínas transportadoras de agua (principalmente a los canales específicos para el transporte de agua (principalmente a los canales específicos para el transporte de agua, o secundariamente a canales que son presumiblemente para transportar
alguna otra molécula, como la glucosa, pero que además facilitan el transporte de agua).

OTROS COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CRIOCONSERVACIÓN

AGENTES QUE INTERACTÚAN CON LA MEMBRANA PLASMÁTICA

El shock por frío esta probablemente relacionado con la transición de fase de la membrana lípidica, cuyos resultados son separación de las fases y la pérdida de permeabilidad selectiva. Diferentes sustancias han demostrado que pueden cambiar la composición lipídica de la membrana celular mejorando su fluidez. La adicción de lecitina (de aceite de soja) o yema de huevo (que contiene fosfolípidos y lecitina) protege a la membrana espermática del shock por frío.

El mecanismo exacto por el cual estas sustancias protegen a la célula del shock por frío es desconocido. Parece que el responsable del efecto de la yema de huevo es una lipoproteína de baja densidad (LDL). Esta LDL puede actuar uniéndose directamente a la membrana y modificando su permeabilidad o activando a enzimas de la membrana (adenilato ciclasa, bombas iónicas,..) que mejorarían el comportamiento osmótico de las célula y la respuesta a crioprotectores permeables como el glicerol.

Además, el posible efecto beneficioso de algún detergente durante la congelación (SDS, etc.) se atribuye a que el detergente modifica las partículas de la yema de huevo (LDL) solubilizando lípidos, lo que facilita la interacción de éstos con la membrana plasmática.

Varios investigadores han proporcionado evidencia directa de que la Albúmina, en el medio de congelación se adhiere rápidamente a la membrana espermática en el momento de la dilución, modifica las composiciones lipídicas del espermatozoide mediante intercambio lípidico o hidrólisis, promueve la hidrólisis de las proteínas de membrana plasmática, causa la entrada de iones Ca2+ en el citoplasma, y disminuye el colesterol y la cantidad de fosfolípidos en la membrana plasmática del espermatozoide. Esta disminución del colesterol induce una mayor fluidez de membrana y por tanto resistencia a la congelación. Otras sustancias con propiedades lipofílicas utilizadas para extraer colesterol de membranas, como el metil-betaciclodextrina (un derivado de un oligómero cíclico de la glucosa), también han demostrado mejorar la supervivencia espermática a la congelación.

QUELANTES (EDTA, CITRATO)

Durante la criopreservación, existe un descontrol de la concentración de calcio intracelular. Este es probablemente el motivo para la inclusión del ácido etilendiaminotetra acético (EDTA) y citrato en algunos diluyentes de semen; estos atraparían calcio y disminuirían el gradiente de concentración en toda la membrana plasmática del espermatozoide. Las concentraciones de calcio 0,1 mM. intracelulares son cuatro veces menores a las del ambiente exterior. El EDTA atrapa otros iones metálicos y podría también actuar inhibiendo la peroxidación de lípidos.

AGENTES QUE EVITAN LA PEROXIDACIÓN LIPÍDICA

Una serie de estudios han implicado a la peroxidación de los lípidos de membrana como causa de la función defectuosa del espermatozoide después de la criopreservación del semen (Salamon and Maxwell, 1995). Los intentos de superar la peroxidación durante la criopreservación de semen han incluido la realización del proceso bajo condiciones anaeróbicas, además del uso de antioxidantes y la inclusión de agentes quelantes. Confirmar la eficacia de estas estrategias ha sido algo problemático. Butirato hidroxitolueno, Glutation y Ditiotreitol han sido descritos como agentes protectores de la peroxidación durante la criopreservación, con mejoras en la motilidad postdescongelación y la integridad acrosomal.

BUFFER

Además de la elección del crioprotector y varios posibles aditivos, los diluyentes de semen deben estar preparados en un medio acuoso. Algunas formulaciones comúnmente utilizadas, especialmente aquellas con alto contenido de azúcar, no contienen un buffer de pH, por lo que componentes como la yema de huevo puede afectar el pH de la solución. Muchos medios incluyen citrato de sodio, TRIS ( t r i s f o s f a t o – ( h i d r o x i m e t i l ) – aminometano) o buffers zwitterionicos como TES (N-trisfosfato (hidroximetil)- metil-2-aminoetanosulponico ácido). No se debe utilizar tampón fosfato salino (PBS) como buffer en la congelación espermática, pues sus elevadas concentraciones de sodio, al alterarse las bombas Na-K durante el proceso de congelación, pueden sen perjudiciales para el espermatozoide alcanzando niveles tóxicos intracelulares.

VITRIFICACIÓN

La Vitrificación es la solidificación de una solución alcanzándose el estado vítreo comentado anteriormente, sin formación de cristales. En este estado el agua se solidifica pero no se expande, esto sucede gracias a un rápido enfriamiento que conduce a un aumento extremo de la viscosidad sin formación de hielo intracelular. Este proceso es alcanzado por aumento tanto de la tasa de enfriamiento como de la concentración de la solución crioprotectora (Taylor et al., 2004).

De hecho aunque introdujéramos directamente una pajuela de congelación en nitrógeno líquido y después lo sumergiéramos en agua para calentarlo las tasas de enfriamiento y calentamiento serían del orden de >2500ºC/min., lo que podría formar cristales de hielo intracelulares, y provocar daños en el espermatozoide. Para aumentar la velocidad de congelación se han utilizado otros dispositivos diferentes a la pajuela clásica que permiten un mayor contacto entre la suspensión celular y el nitrógeno líquido como rejillas de microscopia electrónica, semipajuela, cryoloop, cryotop, cryotip y cryoleaf (Fuller et al., 2004). Las tasas de enfriamiento y calentamiento pueden aumentar hasta 30000 ºC/min y 42000ºC/min respectivamente, y así evitar con éxito la formación de hielo intracelular. Para conseguir esta alta tasa es necesario que el volumen donde están contenidos los espermatozoides sea muy pequeño (micras), lo que hace que el número de espermatozoides vitrificados sea muy escaso, no siendo esta técnica útil para congelaciones de semen destinados a inseminación artificial o FIV, sólo para ICSI.

La mayoría de los protocolos de vitrificación requieren una alta concentración de crioprotectores a fin de deshidratar rápidamente el espermatozoide y prevenir el hielo intracelular. Por lo tanto, la toxicidad de los crioprotectores debe ser considerada para el éxito de la congelación. En general, crioprotectores rápidos y permeables son preferibles porque la rápida permeabilidad acorta el tiempo de exposición, reduce la lesión tóxica y minimiza la hinchazón osmótica durante la eliminación de los crioprotectores. En vitrificación es muy importante durante el calentamiento eliminar el crioprotector rápidamente. Si las células están directamente expuestas a solución isotónica, existe un riesgo de hinchazón osmótica, porque el agua difunde más rápido al interior de la célula que la difusión al exterior del crioprotector desde el espermatozoide. La estrategia más común para evitar este daño es descongelar las células o los embriones en una solución hipertónica que contiene agentes no-permeables para contrarrestar el exceso de flujo de agua. La sacarosa es utilizado usualmente para diluir las células vitrificadas después de la descongelación, actuando como una fuerza osmótica que restringe la permeabilidad del agua en las células, y así evitar “ lesiones por hinchazón”.

Sin embargo, se ha visto que los espermatozoides son capaces de recuperarse con técnicas de vitrificación sin adicción de CPA, utilizando tasas muy altas de enfriamiento que podría depender en cierto grado de una alta permeabilidad innata de la membrana al agua (Isachenko et al., 2004) o utilizando como único crioprotector la sacarosa (Hossain et al., 2007) o el glicerol (Schuster et al., 2003). Por tanto, el papel de las técnicas de vitrificación de espermatozoides está todavía por aclarar.