INTRODUCCIÓN

El avance producido en los sistemas de cultivo durante los últimos años, ha favorecido la obtención de un mayor número de embriones que se desarrollan hasta el estadio de blastocisto (D+5 y D+6), los cuales tienen un mayor poder de implantación (Gardner et al., 1997).

Estudios randomizados muestran queentreel28yel55%delos embriones que se obtienen en el laboratorio evolucionan hasta estadio de blastocisto (Papanikolaou et al., 2008) gracias al uso de estos medios secuenciales. Sin embargo, la capacidad de los embriones de continuar su desarrollo hasta D+5/ D+6 puede oscilar entre un 0 y un 100% en cada paciente.

Este cultivo prolongado permitiría la selección y transferencia de un único blastocisto, reduciendo las tasas de embarazo múltiple asociadas con las técnicas de reproducción asistida (Guerif et al., 2009). De esta forma, surge la necesidad de criopreservar los blastocistos supernumerarios obtenidos en el laboratorio.

La congelación lenta ha sido el método elegido durante mucho tiempo, pero a díadehoylavitrificacióneselprincipal método de criopreservación utilizado para blastocistos, siendo la formación de cristales de hielo el mayor riesgo en ambos procedimientos.

Desde el primer nacimiento obtenido tras la vitrificación de un blastocisto humano utilizando pajuelas de congelación (Yokota et al., 2000), la atención se ha focalizado en utilizar pequeños volúmenes de crioprotector paraevitarenmayormedidasusefectos tóxicos. Esta eficacia se demuestra por los porcentajes de supervivencia obtenidos en blastocistos tempranos usando cryotop (Kuwayama et al., 2000), cryoloop (Mukaida et al., 2001, 2003; Read et al., 2002), redes de microscopía electrónica o celdas (Choi et al., 2000; Son et al., 2003) y pajuelas de congelación (Vanderzwalmen et al., 2003).
Sin embargo, los blastocistos expandidos muestran un porcentaje de supervivencia menor después de la vitrificación (Cho et al., 2002), debido a la existencia de un mayor volumen de líquido que en los blastocistos tempranos, de manera que aumenta el riesgo de formación de cristales de hielo durante el proceso de enfriamiento.

Durante el desarrollo embrionario, el blastocisto experimenta numerosos cambios morfológicos. Al expandirse, se acumula en el blastocele una concentración mayor de Na+ y K+, provocando una presión, no solo en la zona pelúcida, sino también en el trofoectodermo. Al mismo tiempo, el trofoectodermo libera lisinas implicadas en el adelgazamiento de la zona pelúcida, en concordancia con los ciclos de contracción y expansión del blastocisto.

El razonamiento del colapso artificial está basado en estos ciclos de expansión y contracción y extensión citoplasmática del trofoectodermo. Esta técnica es usada y considerada como un paso esencial para mejorar laeficaciadelavitrificaciónparael estadio de blastocisto.

Varios estudios han observado un incremento en la tasa de supervivencia de blastocistos cuando el volumen del blastocele había sido reducido artificialmente (Vanderzwalmen et al., 2003; Son et al., 2003; Hiraoka et al., 2004; Mukaida et al., 2006)

La ventaja del colapso es que aumenta la eficiencia del protocolo de vitrificación en cuanto a la reducción de la formación de cristales de hielo por la disminución del contenido hídrico presente en el blastocele.

El objetivo de nuestro estudio fue determinar el impacto del colapso en nuestro programa de vitrificación de blastocistos mediante una aguja de microinyección y determinar la seguridad de este procedimiento.

MATERIAL Y MÉTODOS

Este estudio fue realizado entre febrero de 2010 y agosto de 2012, incluyendo en este periodo pacientes sometidas a tratamientos de FIV cuyos embriones sobrantes habían dado lugar a blastocistos expandidos en D+5 o D+6 siendo vitrificados aquellos de calidad óptima (3-4 de expansión, y en cuanto a trofoectodermo y MCI, las combinaciones A/A, A/B, B/B, A/C, B/C, según la clasificación de Gardner).

Como grupo control incluimos pacientes con blastocistos expandidos enD+5oD+6aloscualesnoseles realizó colapso previo a la vitrificación. En el grupo de estudio se incluyeron aquellas pacientes con blastocistos expandidos en D+5 o D+6 a las cuales se les realizó el colapso previo a la vitrificación.
Las pacientes fueron tratadas con agonistas de la GnRH, según protocolo corto o largo de estimulación, y posterior administración de hCG, cuando los folículos poseían un diámetro de 17 mm. Los ovocitos fueron recuperados entre 36 y 38 horas posadministración de hCG, mediante punción folicular transvaginal ecoguiada.

Los ovocitos recuperados fueron cultivados en IVF Plus de Vitrolife a37oCyun6%deCO2,durante2 horas. En ese momento, se realizó la decumulación enzimática y mecánica de los mismos. Durante la fase enzimática, los ovocitos fueron transferidos a la hialuronidasa de Vitrolife, HyaseTM-10X, subiéndolos y bajándolos con una pipeta Pasteur de vidrio. Posteriormente, los ovocitos fueron lavados en un medio tamponado, Gamete de Vitrolife, y son decumulados mecánicamente utilizando una Stripper de 130 μm.

Una vez retiradas las células del cúmulo, se clasificaron y separaron los ovocitos según su estadio de madurez (metafase II, metafase I o profase I), y se cultivaron durante 2-3 horas en las mismas condiciones previas a la decumulación.

Durante ese tiempo, las muestras seminales que iban a ser utilizadas para la fecundación, fueron procesadas mediante swim-up.

A las 2-3 horas posdecumulación, los ovocitos fueron fecundados mediante microinyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).

Tras realizar la ICSI, los ovocitos fueron cultivados hasta el día siguiente en IVF plus de Vitrolife en condiciones atmosféricas de 37oC y 6% de CO2.

CULTIVO EMBRIONARIO

La fecundación fue valorada entre 16 y 19 horas posmicroinyección, por la presencia de 2 pronúcleos, siguiendo la clasificación de Scott (2000) (Figura 1), así como la observación del número y apariencia de corpúsculos polares y la presencia de halo citoplasmático.

En ese momento, los zigotos fueron transferidos a medio G1 Plus de Vitrolife donde fueron cultivados durante 48-72 horas. Todo el cultivo fue realizado en una atmósfera de CO2 al 6%.

En D+3, fueron transferidos a las pacientes uno o dos preembriones de calidad A y/o B según la clasificación embrionaria de ASEBIR.

Los preembriones supernumerarios fueron cultivados hasta el estadio de blastocisto en medio G2 Plus (Vitrolife Serie GTM, Sweden) realizando el cultivo en una atmósfera de triple gas (6% CO2, 5% O2 y 89% N2).

En D+5 los blastocistos desarrollados fueron examinados, clasificando cada blastocistosegúnelcriteriodecalidad de Gardner y colaboradores (Gardner et al., 2000). Los blastocistos fueron clasificados teniendo en cuenta su apariencia morfológica, atendiendo inicialmente a su grado de expansión del 1 al 6. Seguidamente, se evaluó la masa celular interna (MCI) clasificándola como A (muchas células fuertemente empaquetadas), B (varios grupos de células ligeramente empaquetadas), C (pocas células) y D (ausencia de masa).

El trofoectodermo fue clasificado como A (muchas células formando un epitelio cohesivo), B (varias células formando epitelio), C (pocas células) y D (ausencia celular).

Tras valorar el estadio de desarrollo y calidad del blastocisto, se vitrificaron aquellos embriones clasificados como AoB. Si los blastocistos eran clasificados como C a nivel del trofoectodermo o MCI, también eran vitrificados, descartando la criopreservación en aquellos embriones que tanto en la MCI como en el trofoectodermo mostraban una clasificación tipo C o D.

COLAPSO ARTIFICIAL DE BLASTOCISTOS EXPANDIDOS

La técnica del colapso utilizando una aguja de microinyección fue descrita previamente por Vanderzwalmen et al. (2002).

Previamente a la vitrificación, los blastocistos expandidos fueron colocados en microgotas de 50 μl del medio para blastocistos (Vitrolife Serie GTM, Sweden).

Mediante una pipeta de sujeción colocada en un sistema de micromanipulación, la MCI es posicionada a las 6 o las 12, introduciendo la aguja entre la unión de dos células del trofoectodermo. Las uniones celulares pueden reparar el orificio realizado, por este motivo es importante mover la aguja varias veces consecutivas con el fin de establecer una buena rotura entre las células (Figura 2).

Una vez realizada la técnica, observamos la contracción del blastocele, momento adecuado para vitrificar el blastocisto y almacenarlo en el tanque de nitrógeno líquido.

Figura 2. Colapaso artificial de blastocistos expandidos con una aguja de microinyección

(A1) Blastocisto expandido conectado a una micropipeta de sujeción e inserción con una micropipeta ICSI.

(B1, C1) Movimiento continuo de la aguja de microinyección entre dos células.

(A2) Comienzo de la contracción del blastocele.

(B2) Contracción parcial del blastocele.

(C2) Contracción completa del blastocele.

 

VITRIFICACIÓN DE BLASTOCISTOS

Los blastocistos colapsados y no colapsados fueron vitrificados utilizando como soporte de vitrificación el cryotop (Kitazato BioPharma Co., Shizuoke Japan) y como medios de vitrificación, Vitrification Freeze Kit (Vit Kit® – Freeze) de Irvine Scientific, California, USA.

En cada cryotop, los blastocistos fueron vitrificados de manera individual o de dos en dos.

Previo al inicio del proceso de vitrificación, los medios fueron atemperados durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Los blastocistos seleccionados para vitrificar fueron colocados en el medio de equilibrado (ES) a temperatura ambiente.

El tiempo de exposición al medio ES dependerá de si el blastocisto está colapsado o no. Si se realizó colapso, el tiempo de exposición fue de 8 minutos; sin colapso el tiempo aumenta hasta 15 minutos.

Después de ese tiempo, transferimos los blastocistos a una gota del medio de vitrificación (VS), en la que los lavamos para eliminar los restos de medio ES, y los cargamos en el soporte de vitrificación con el menor volumen de medio posible.

Retiramos el exceso de medio existente entorno a los blastocistos, y sumergimos el cryotop rápidamente en el nitrógeno líquido. Este último paso debe llevarse a cabo en un máximo de tiempo de 90 segundos.

Los blastocistos vitrificados fueron almacenados en el banco de embriones hasta que la paciente lo requiera.

DESVITRIFICACIÓN DE BLASTOCISTOS

Al igual que en el proceso anterior, los medios fueron atemperados previo al inicio de la desvitrificación.

Los cryotop con los blastocistos que se van a desvitrificar son transferidos a un recipiente de menor tamaño con nitrógeno líquido, que colocaremos al lado de la lupa.

Retiramos la cubierta de plástico del cryotop, sin que la zona donde están colocados los blastocistos salga fuera del nitrógeno líquido; rápidamente introducimos y agitamos la lengüeta del cryotop con los blastocistos en el medio de desvitrificación (TS) durante 1 minuto.

Después transferimos los blastocistos a las gotas de medio de dilución (DS), dejándolos durante 2 minutos en cada una de las dos gotas.

Finalmente, se eliminan los restos de crioprotector al transferir los blastocistos a las 3 gotas de medio de lavado (WS), manteniéndolos 3 minutos en cada una de ellas.

Los blastocistos desvitrificados fueron cultivados en microgotas de medio G2 Plus Vitrolife Serie GTM, Sweden, de 2 a 4 horas en ambiente de triple gas (5% CO2, 5% O2 y 90% N2).

La supervivencia de los blastocistos fue determinada por la presencia de cavidad blastocélica 2 horas después del cultivo in vitro y fueron transferidos al útero de las pacientes 4 horas posdesvitrificación.

Se administró progesterona por vía vaginal (600 mg/día), así como 6 comprimidos al día de Progynova (Bayer Hispania, S.L.) para mantener la fase lútea.
El resultado de embarazo fue confirmado 11 días más tarde mediante la determinación en suero de la fracción beta de la hCG.

ESTADÍSTICA

Los datos fueron analizados mediante el análisis de χ2 para determinar las diferencias existentes en el porcentaje de supervivencia, implantación y embarazo.

Para ello fue utilizado el programa SPSS para Windows, considerando como significación estadística un valor de p< 0,05.

RESULTADOS

En nuestro laboratorio hemos estudiado el impacto del colapso artificial en blastocistos expandidos en D+5 y D+6 previo a la vitrificación de los mismos. La tabla I resume las características de las pacientes y el porcentaje de supervivencia y embarazo de blastocistos humanos vitrificados con colapso (grupo de estudio) o sin colapso (grupo control).

Como grupo control, hemos realizado 49 ciclos de desvitrificación en los que hemos desvitrificado un total de 75 blastocistos no colapsados, de los que sobrevivieron 58 (77%). En este grupo, fueron canceladas 9 transferencias por no supervivencia.

En nuestro grupo de estudio hemos incluido 36 ciclos de desvitrificación en los que fueron desvitrificados un total de 52 blastocistos colapsados, de los cuales sobrevivieron 51 (98,1%). En este caso, tan solo se canceló 1 transferencia.

La tabla 2 resume los resultados obtenidos con y sin colapso artificial previo a la vitrificación.

La tasa de supervivencia entre ambos grupos muestra diferencias estadísticamente significativas a favor del colapso artificial previo a la vitrificación (p< 0,005).

En el grupo control, la tasa de implantación obtenida fue un 32,7%, mientras que en el grupo de estudio fue un 29,4%, siendo estas diferencias no significativas (p> 0,05)

En cuanto a las tasas de embarazo, los resultados fueron similares entre ambos grupos; 50% en el grupo control y 51% en el grupo de estudio, no encontrando diferencias significativas (p> 0,05).

DISCUSIÓN

Tradicionalmente muchas de las unidades de Reproducción Asistida realizan la transferencia de preembriones humanos en D+3. Al mismo tiempo, la mentalidad de las unidades de reproducción ha ido cambiando, cultivando cada vez más preembriones hasta estadio de blastocisto con la intención de poder seleccionar un único embrión de calidad óptima. Este hecho genera un mayor número de embriones sobrantes en estadio de blastocisto disponibles para la congelación.

Varios estudios de experimentación animal han evaluado el estadio de desarrollo con respecto a la supervivencia embrionaria durante la criopreservación.
Hochi y colaboradores confirmaron la influencia del volumen embrionario en relación a la supervivencia de blastocistos equinos tras descongelación. Los blastocistos de diferentes tamaños <200μm (blastocisto temprano), 200-300 μm (blastocisto parcialmente expandido) y mayor de 300 μm (blastocisto haciendo eclosión) obtienen un grado de supervivencia mayor cuando el volumen del blastocisto a la hora de la vitrificación es menor.

Un estudio realizado por Zhou y colaboradores (2005) también confirmó que el mejor estadio para vitrificar un blastocisto era el que correspondía al blastocisto con menor volumen.

Los diferentes estadios de maduración del blastocisto tienen un impacto en el éxito de la vitrificación. El blastocisto con una pequeña cavidad blastocélica y no expandido difiere estructuralmente del blastocisto expandido. Un blastocisto expandido contiene un gran volumen de líquido, lo que provoca un mayor tiempo de exposición a los crioprotectores y un mayor riesgo de formación de cristales de hielo. Por este motivo, tal y como se recoge en varios estudios de animales y humanos, la utilización de un procedimiento adicional de reducción artificial previo a la vitrificación evitaría este problema. (Chen Su et al., 2005; Vanderzwalmen et al., 2002; Mukaida et al., 2003).

Nuestro estudio sugiere que la utilización del colapso en blastocistos expandidos previo a la vitrificación mejora la tasa de supervivencia reduciendo de esta forma la tasa de cancelación.

Han sido evaluados un total de 85 ciclos de blastocistos vitrificados, de los cuales, a 36 ciclos se les aplicó la técnica del colapso artificial, con un porcentaje de supervivencia del 98,1%. Este resultado demuestra que el colapso de blastocistos expandidos puede ayudar a mejorar los resultados obtenidos en un programa de vitrificación.

Esta observación concuerda con el estudio realizado por Vanderzwalmen y colaboradores (2002), donde la eficiencia de la vitrificación de blastocistos humanos estuvo correlacionada negativamente con el grado de expansión del blastocele.

En nuestro estudio, el porcentaje de supervivencia en blastocistos no colapsados fue claramente inferior (77%). Esta diferencia puede ser debida a una inapropiada deshidratación y permeabilización del crioprotector.

Varios autores han publicado que el daño mecánico causado por la formacióndecristalesdehielodebería ser evitado reduciendo el contenido hídrico del blastocele, utilizando para ello distinta metodología: agujas de microinyección (Son, 2003; Vanderzwalmen, 2002), utilización de una pipeta de diámetro menor (Hiraoka, 2004) y mediante el uso del láser (Hiraoka, 2008; Mukaida, 2006). En todos estos trabajos se recoge una mejora en el porcentaje de supervivencia tras realizar el colapso.

En cuanto a las tasas de implantación y de embarazo, no observamos diferencias significativas entre ambos grupos, resultado que puede ser debido al pequeño tamaño muestral del estudio.

En conclusión, este estudio confirma la seguridad de la técnica del colapso previo a la vitrificación de blastocistos, y puede ser utilizada como método adicional para mejorar la eficiencia de la vitrificación de blastocistos en nuestros laboratorios.