Desde el nacimiento de Louise Brown a finales de los años 70, el desarrollo y aplicación de técnicas de reproducción asistida (TRA) ha permitido superar muchos casos de infertilidad. Sin embargo, considerando su impacto social, cabe plantearse si la investigación básica asociada a las TRA avanza de forma sincrónica a su aplicación, con el objetivo de incrementar el conocimiento de la biología de gametos y embriones procedentes de la población infértil, aportando así información de gran relevancia que permita, tanto mejorar el éxito del ciclo de reproducción, como garantizar la seguridad para la descendencia.

En el área de la genética humana se ha observado un incremento de individuos portadores de anomalías cromosómicas constitucionales (de Braekeleer and Dao, 1991), de anomalías meióticas (Egozcue et al., 1983) o de gametos cromosómicamente desequilibrados (Arán et al., 1999; Vegetti et al., 2000; Rubio et al., 2001) en poblaciones de individuos con problemas de fertilidad. El estudio del cariotipo de la pareja, el diagnóstico genético preimplantacional y estudios citogenéticos en células germinales, permiten ofrecer consejo genético y acotar el riesgo de que la descendencia pueda heredar anomalías cromosómicas o genéticas, en el caso de que alguno de los progenitores sea portador de anomalías cromosómicas o monogénicas, en casos de abortos de repetición o edad avanzada, o en casos en los que existe un bloqueo meiótico causado por un incremento de anomalías cromosómicas en las células germinales.

Mientras que los riesgos genéticos cada vez están más acotados, en la actualidad la investigación también se centra en elucidar si existen riesgos epigenéticos asociados a la aplicación de TRA.

Epigenética e impronta genómica.

El término epigenética se refiere a cambios heredables que no implican variaciones en la secuencia de nucleótidos en la molécula de DNA, pero sí regulan la expresión génica. Estos cambios incluyen la metilación del DNA en el carbono 5 de las bases citosina en dinucleótidos CpG y modificaciones postraduccionales en los extremos N- terminales de las histonas. Estas modificaciones covalentes actúan conjuntamente modificando la conformación de la cromatina. El DNA de células eucariotas se encuentra empaquetado mediante la formación de nucleosomas que consisten en 146 pares de bases de la molécula de DNA, organizadas alrededor de un octámero de 4 proteinas histonas (H2A, H2B, H3 y H4). Dependiendo del estado de metilación del DNA, así como de modificaciones represoras o activadoras de las proteínas histonas (principalmente metilaciones y acetilaciones en aminoácidos lisina), la cromatina adopta una conformación cerrada (heterocromatina) o abierta (eucromatina) (Figura 1). La conformación de la cromatina en forma de heterocromatina se asocia a represión génica, dado que el DNA es inaccesible a la maquinaria de transcripción, mientras que la conformación en forma de eucromatina se asocia a expresión génica.

El término epigenética engloba la impronta genómica, un sistema de regulación de la expresión génica, presente en especies de gestación intrauterina (Das et al., 2009), que consiste en marcar diferencialmente, mediante modificaciones epigenéticas, determinados genes en función de su origen parental, de manera que sólo se expresa el alelo materno o paterno. Considerando el comportamiento diferencial de alelo de estos genes, la impronta genómica es, junto con los caracteres ligados a los cromosomas sexuales y a los genes mitocondriales, una de las excepciones al principio mendeliano básico de equivalencia, el cual describe la inexistencia de diferencias en el comportamiento de los genes de origen paterno y materno.

Las primeras evidencias de la existencia de impronta genómica surgieron de los resultados obtenidos en experimentos de transferencia nuclear. En 1984 Surani y colaboradores y McGrath y Solter crearon embriones murinos ginogenéticos y androgenéticos, es decir, embriones con dos pronúcleos o genomas maternos o con dos pronúcleos o genomas paternos, respectivamente (Surani et al., 1984; McGrath and Solter, 1984). La presencia del genoma materno y paterno implica el desarrollo de un embrión y tejidos trofoblásticos normales. En cambio, los embriones ginogenéticos crecen relativamente bien, pero los tejidos trofoblásticos (la placenta) son atróficos. En el caso de los androgenéticos, los embriones apenas se desarrollan aunque las placentas son de gran tamaño (Surani et al., 1984; McGrath and Solter, 1984). La conclusión inmediata frente a estos resultados es que la contribución genética paterna es primordial para el desarrollo de la placenta y la materna lo es para el correcto desarrollo embrionario.

Otra evidencia de la existencia de impronta genómica proviene del hecho de que disomías uniparentales (DUP) de ciertos cromosomas tengan como consecuencia el desarrollo de síndromes o anomalías del crecimiento. Este es el caso de los síndromes de Prader-Willi y Angelman, que pueden ser originados por DUP materna o paterna del cromosoma 15, respectivamente (Cassidy and Schwartz, 1998; Cassidy et al., 2000) y de los síndromes de Beckwith-Wiedemann y de Silver- Russell, que pueden ser causados por DUP paterna del cromosoma 11 y DUP materna del cromosoma 7, respectivamente (Eggermann et al.,2008). Es también ampliamente conocido que DUP del cromosoma 14 causa diferentes fenotipos de crecimiento anómalo, dependiendo del origen de la DUP (Murphy et al., 2003).

En resumen, determinadas anomalías fenotípicas pueden ser causadas por la herencia de dos copias maternas o paternas de determinados genes, manifestando la presencia de genes con un comportamiento específico de alelo y su relevancia en el desarrollo. Además de DUP, anomalías epigenéticas que conllevan la expresión bialélica (ausencia de metilación en ambas copias) o no expresión (presencia de metilación en ambas copias) de genes regulados por impronta genómica, pueden resultar no sólo en el desarrollo de síndromes y anomalías del crecimiento, sino también en el desarrollo de cáncer, diabetes neonatal transitoria (Temple, 2007) y pseudohipoparatiroidismo (Bastepe, 2008), dependiendo del gen o genes afectados. Considerando la función de determinados genes regulados por impronta genómica en el desarrollo cerebral y fetal, la etiología del autismo y de la esquizofrenia (Badcock and Crespi, 2006) así como la preeclampsia (Enquobahrie et al., 2008), la restricción del crecimiento intrauterino (McMinn et al., 2006; Diplas et al., 2009) y el bajo desarrollo para la edad gestacional (Guo et al., 2008) han sido relacionados con anomalías en la impronta genómica.

Actualmente se conocen aproximadamente 60 genes regulados por impronta genómica en humanos, mapados en diversos cromosomas. Cabe comentar que los genes regulados por impronta genómica suelen encontrarse agrupados en dominios cromosómicos formando un cluster de genes. La expresión monoalélica de todos los genes agrupados en un determinado dominio, se encuentra bajo el control de una única región, denominada centro regulador de la impronta (Imprinting Control Region; ICR). Las ICR del genoma se corresponden con lo que se conoce como región diferencialmente metilada (Differentially DNA-Methylated Region; DMR). Estas regiones del genoma contienen islas CpG (regiones con un alto contenido de CpG) y son en las que se establece la metilación del DNA y las modificaciones represoras de histonas que conllevan la heterocromatinización de toda la región de forma específica de alelo.

Herencia epigenética y de la impronta genómica

Después de la fecundación, el zigoto resultante hereda la copia materna y paterna de todos los genes del genoma, los cuales deben transmitirse de forma fiel a lo largo de la posterior proliferación celular, asegurando que todas las células del organismo compartan la misma información genética. Para el desarrollo es también imprescindible la diferenciación celular. Del hecho de que células genéticamente idénticas sean tan diferentes funcional y morfológicamente, es responsable la epigenética, la cual regula la expresión o represión de unos u otros genes del genoma en función del tipo celular. Por ello, después de la fecundación y durante las primeras etapas del desarrollo embrionario, los patrones epigenéticos específicos de ovocito y espermatozoide son eliminados mediante una desmetilación global de ambos genomas. En el estadio de blastocisto, emergen los patrones epigenéticos específicos de cada tipo celular (Figura 2A). Estos patrones deben ser transmitidos a través de la mitosis, para conservar el estado de diferenciación y funcionalidad en las células hijas.

A pesar de la flexibilidad epigenética, que permite la diferenciación celular, los patrones epigenéticos que controlan la expresión monoalélica de genes regulados por impronta genómica son, en términos generales, comunes en todos los tipos celulares, y es especialmente crucial que se mantengan desde la fecundación y a lo largo de las primeras etapas de la embriogénesis, para el correcto desarrollo del embrión, de los tejidos extraembrionarios y para el correcto desarrollo neurológico (Figura 2A). Por lo tanto, la metilación diferencial de alelo de los genes regulados por impronta genómica debe ser heredada de ovocitos y espermatozoides, y debe mantenerse o protegerse frente a la desmetilación global que permite la reprogramación epigenética del genoma. Para asegurar la transmisión de la metilación monoalélica de estos genes, existe el mecanismo de reprogramación de la impronta genómica en la línea germinal (Figura 2B). Este ciclo de reprogramación evita que el 50% de los gametos haploides, procedentes de las células germinales primordiales diploides, sean portadores de la copia metilada y el otro 50% sean portadores de la no metilada. Frente a esta situación, un ovocito portador de la copia metilada de un determinado gen regulado por impronta genómica, podría ser fecundado por un espermatozoide también portador de la copia metilada, de modo que el zigoto resultante sería portador de una anomalía en la impronta genómica dado que ambas copias del gen se encontrarían inactivas o silenciadas, conllevando a posibles anomalías del desarrollo. Del mismo modo, si un ovocito portador de la copia no metilada fuera fecundado por un espermatozoide también portador de la copia no metilada, el zigoto resultante expresaría ambas copias del gen, hecho que también se correlaciona con una anomalía en la impronta genómica, con consecuencias fenotípicas. Para evitar esta situación, en las células germinales primordiales la impronta genómica se borra, y se establecen los patrones de metilación específicos de alelo de los genes regulados por impronta genómica durante la gametogénesis, en función del sexo. Así, aquellos genes en los que su patrón de impronta se correlaciona con metilación materna, establecerán dicha metilación durante la ovogénesis en todos los ovocitos. El establecimiento de la impronta materna se realiza durante la maduración ovocitaria (Sato et al., 2007), habiéndose considerado por algunos autores que ésta no se completa hasta el momento de la fecundación o justo después de ésta (El- Maarri et al., 2001). En el caso de los genes en los que su patrón de impronta se correlaciona con metilación paterna, ésta se establecerá durante la espermatogénesis, siendo completa en las espermatogonias del individuo adulto (Kerjean et al., 2000). De este modo, todos los ovocitos y espermatozoides serán portadores de la impronta específica de alelo para cada uno de los genes regulados por impronta genómica, asegurando la herencia de un patrón normal de metilación de una de las dos copias de estos genes, y, por ende, asegurando su posterior expresión monoalélica durante el desarrollo.

Impronta genómica y Técnicas de reproducción asistida

Tanto la metilación del DNA como las modificaciones en las proteínas histonas son susceptibles de presentar alteraciones que pueden ser consecuencia de: factores genéticos (anomalías en los genes que codifican factores implicados en el establecimiento y/o mantenimiento de la metilación) (Zetterberg et al., 2003; Park et al., 2005; Lee et al., 2006; Zogel et al., 2006; Kobayashi et al., 2009); factores ambientales intrauterinos (Lim et al., 2010); exposición a toxinas (Anway and Skinner, 2008); tratamientos hormonales (Pathak et al., 2008, 2010); diferencias dietéticas (Chmurzynska, 2010).

El conocimiento sobre los mecanismos y las etapas de establecimiento de la impronta genómica, junto con la aparición de datos epidemiológicos que relacionan un moderado incremento en el riesgo del desarrollo de síndromes relacionados con anomalías en la impronta genómica en la población de niños concebidos mediante reproducción asistida (Cox et al., 2002; Ørstavik et al., 2003; Maher et al., 2003; Gicquel et al., 2003; DeBaun et al., 2003), ha focalizado la atención de especialistas en epigenética e impronta genómica en la investigación relacionada con la reproducción asistida. En todos los casos descritos en estos estudios epidemiológicos, la causa del síndrome es la pérdida de metilación (Loss of Imprinting -LOI-) en el alelo materno.

Cultivo in vitro de embriones, hiperestimulación ovárica y maduración in vitro de ovocitos

La aplicación de TRA implica mayoritariamente la fecundación y el desarrollo embrionario temprano en condiciones in vitro, siendo omitido del proceso el ambiente uterino. Existen múltiples datos experimentales obtenidos de modelos animales, que avalan una relación entre el cultivo in vitro de embriones, así como la composición de los medios de cultivo y la transferencia embrionaria en condiciones de asincronía con el estado uterino, y el desarrollo del síndrome de sobrecrecimiento, conocido como Large offspring syndrome (LOS) y causado por anomalías en genes regulados por impronta genómica (Young et al., 1998; Sinclair et al., 2000; Young et al., 2001; Mann et al., 2004; Li et al., 2005). Además de los efectos fenotípicos inmediatos, debe considerarse la posibilidad de que el cultivo in vitro pueda tener efectos a largo plazo. En este contexto, se ha descrito una relación entre el desarrollo de obesidad, ansiedad y déficit de memoria asociados a anomalías en la impronta, en descendencia obtenida mediante cultivo in vitro en el modelo murino (Fernández-Gonzalez et al., 2007). Cabe mencionar que en embriones murinos obtenidos por transferencia intrauterina de zigotos obtenidos in vivo, también se han descrito LOI, concretamente en tejidos extraembrionarios. Estas anomalías se intensifican y están presentes, no solo en los tejidos extraembrionarios sino también en el embrión, cuando los embriones son cultivados in vitro antes de su transferencia (Rivera et al., 2008). Este hecho plantea que, así como la manipulación de embriones previa a su implantación puede tener un efecto deletéreo sobre el mantenimiento de la impronta genómica per se, la práctica metodológica común en ambos casos es la hiperestimulación ovárica.

En la práctica habitual de técnicas de reproducción asistida, es complicado aislar la exposición a hormonas, que a su vez conlleva la maduración de múltiples ovocitos inducida por el tratamiento hormonal, y el posterior cultivo embrionario.

Considerando que el período de establecimiento de la impronta genómica materna es coincidente con la maduración de los ovocitos, es lógico plantearse que tanto la hiperestimulación ovárica como la maduración in vitro de ovocitos también puedan influir en la impronta, en este caso en su establecimiento. En el año 2007, Sato y colaboradores presentaron un estudio de metilación de diversos genes regulados por impronta genómica, realizado en ovocitos de ratón y humanos en diferentes estados de maduración y en ovocitos madurados in vitro. En el caso de los ovocitos humanos, los autores analizaron tanto ovocitos inmaduros procedentes de exámenes laparoscópicos de población, así como ovocitos en diferentes estados de maduración obtenidos mediante hiperestimulación de pacientes infértiles (Sato et al., 2007). Sus resultados apuntan de forma consistente la presencia de LOI de diversos genes regulados por impronta, que correlacionan tanto con la hiperestimulación ovárica como con la maduración in vitro de ovocitos. Además, en un estudio reciente del efecto de la hiperestimulación en la impronta genómica, realizado en modelo murino, se ha descrito un efecto dosis-dependiente sobre la metilación del DNA, no sólo en forma de pérdida de metilación sino también por la presencia de metilación aberrante en el alelo materno en genes en los que la metilación se establece en el paterno (Market-Velker et al., 2010). A pesar de ser resultados concluyentes y que en modelo murino queda excluido el componente infértil, éste no debe ser excluido en humanos como consecuencia de la presencia de anomalías en la impronta genómica.

Infertilidad y anomalías en la impronta genómica

Del mismo modo en que anomalías genéticas o cromosómicas explican casos de bloqueo meiótico, anomalías en la impronta genómica pueden explicar casos de infertilidad idiopática. Este planteamiento no puede ser demostrado experimentalmente en el caso de la meiosis femenina, por la limitación de obtener ovocitos sin hiperestimulación. Aún así, a partir de datos epidemiológicos obtenidos de madres de pacientes con síndrome de Angelman, causado por ausencia de metilación materna, Ludwig y colaboradores demostraron una correlación entre infertilidad y la presencia de estas anomalías (Ludwig et al., 2005). En el caso de la meiosis masculina, han sido publicados múltiples trabajos experimentales confirmando la relación entre la presencia de anomalías en la impronta y oligo-, terato- y astenozoospermia (Marques et al., 2004; Kobayashi et al., 2007; Marques et al., 2008, 2009; Kobayashi et al., 2009; Boissonnas et al., 2009; Poplinsky et al., 2009; Hammoud et al., 2009). Cabe apuntar que, a pesar de que los resultados de estos trabajos avalan con claridad la presencia de anomalías en la impronta e infertilidad, en la mayoría de ellos no se incluyen poblaciones control de referencia, por lo que dicha relación podría tener una menor incidencia que la descrita hasta la actualidad en la literatura. Si la presencia de este tipo de anomalías en espermatozoides de individuos infértiles fuera tan elevada como la sugerida en estos trabajos, cabría esperar una mayor incidencia de síndromes causados por anomalías en la impronta paterna en la descendencia concebida mediante técnicas de reproducción asistida. Contrariamente, no existen datos epidemiológicos que apunten a un incremento en la incidencia de estos síndromes causados por anomalías paternas, a diferencia de los datos que sí apuntan a un incremento moderado de síndromes causados por anomalías maternas. Sin embargo, y teniendo en cuenta que los genes paternos contribuyen mayoritariamente al desarrollo de tejidos extraembrionarios, resulta atractivo plantear la hipótesis de que las anomalías presentes en espermatozoides de individuos infértiles puedan ser, o bien más deletéreas para la implantación y/o gestación, o bien puedan quedar confinadas a la placenta y verse reflejadas en una mayor incidencia de restricción del crecimiento uterino, consecuencia de una transferencia limitada o anómala de nutrientes de la madre al feto. Será interesante aportar datos experimentales que contribuyan a confirmar o rehusar esta hipótesis.