INTRODUCCIÓN

Es mucha la bibliografía que se ha escrito describiendo qué parámetros son los adecuados en la valoración de los embriones para intentar encontrar cuáles de ellos son los que tienen una mayor probabilidad de implantación. En la transferencia de embriones en estadio celular (D+2 o D+3), la valoración del número de células, la simetría entre blastómeras, el grado de fragmentación y la presencia de multinucleación (MNC) suelen ser los principales parámetros a tener en cuenta para decidir qué embrión o embriones son los óptimos para transferir. La multinucleación es un fenómeno habitual en los laboratorios de FIV y se ha relacionado con la presencia de alteraciones genéticas en los embriones en los que se observa, así como con una menor tasa de implantación, a pesar de que, en cultivo, a menudo los embriones que presentan MNC son capaces de desarrollarse hasta estadio de blastocisto.

Hay cierta variabilidad en lo que a incidencia de MNC se refiere en la bibliografía, tanto cuando se valora por número de ciclos como cuando se valora en relación al número de embriones con MNC. En cualquier caso y, debido a la menor tasa de implantación que lleva asociada, la MNC es un fenómeno a evitar, por lo que resulta importante saber cuáles son las razones que favorecen su aparición para así poder evitarlas.

A partir del estudio realizado por Eric Van Royen et al. (Human Reproduction 18, 1062-1069) hemos realizado en nuestro centro un análisis retrospectivo y descriptivo de la incidencia de multinucleación (MNC) en D+2 en embriones de FIV-ICSI en relación a: número de ovocitos obtenidos por ciclo, dosis de FSH utilizada en la estimulación, técnica de inseminación (FIV o ICSI) y grado de fragmentación embrionaria.

MATERIAL Y MÉTODOS

Hemos analizado 3224 embriones obtenidos en 460 ciclos realizados en nuestro centro entre el 31 de enero de 2005 y el 31 de diciembre de 2006 (350 ciclos correspondían a pacientes y 110 a casos de donación de ovocitos; el promedio de edad era, respectivamente, 34.7 y 26.1 años).

Para la preparación de las muestras de semen, se utilizó el protocolo estándar de centrifugación en gradientes de densidad (75% – 90%) (Puresperm 100, Nidacon) y dilución del pellet recuperado en medio IVF (IVF Medicult).

Tras la recuperación de los complejos cúmulo-corona-ovocito (CCO) bajo lupa en el laboratorio, estos se mantuvieron en placas de 4 pocillos con G-Fert (Vitrolife) en incubador a 37 ºC, 6% CO₂. En los casos de FIV convencional, se cambiaron los CCO a pocillos de 0,5 ml de IVF (IVF Medicult) a razón de entre 3 – 5 CCO por pocillo, mientras que los ovocitos destinados a ICSI, se colocaron en gotas de 35 μl de Hyasa (COOK) durante 30 segundos para, acto seguido, denudarlos mecánicamente por pipeteo con pipetas de diámetro decreciente en gotas de 30 μl de MOPS (Vitrolife). Una vez denudados los ovocitos, estos eran incubados en un pocillo limpio de G-Fert hasta el momento de la microinyección.

En los ciclos de fecundación mediante FIV convencional, para la co-incubación entre los CCO y los espermatozoides se utilizó medio IVF (IVF, Medicult) a 37 ºC, 6% CO₂ durante un tiempo de inseminación de entre 3 – 5 horas, pasadas las cuales se cultivaban los CCO de forma individualizada en microgotas de 30 μl de G1 hasta la valoración de pronúcleos.

Se realizó ICSI en todos los ovocitos maduros en los casos en que la muestra era indicada para ello y en al menos la mitad de los ovocitos en la práctica totalidad de los ciclos con recuperación espermática suficiente para la FIV convencional, para evitar posibles fallos de fecundación en FIV con la consiguiente imposibilidad de transferencia embrionaria.

El cultivo de los ovocitos se realizó en placas Falcon embriotestadas, bajo aceite (COOK Oil) en gotas de G1 de 30 μl, en un incubador (Labotect Incubator C200) a 37 ºC y al 6% CO₂.

La valoración de los pronúcleos (a las 18h + 2) así como la división embrionaria (a las 42h + 2) se realizó en microscopio invertido Nikon Eclipse TE200 a 400X y girando el embrión si era necesario para la observación de los núcleos en las distintas células.

Para la valoración de los resultados, a partir de la tasa de MNC general de nuestro laboratorio (ver apartado Resultados), se establecieron dos grupos según presentaran una tasa de MNC por caso comprendida dentro de los valores normales o una tasa de MNC por caso más elevada de lo esperado. Para cada uno de estos grupos se valoró la tasa de MNC según la dosis de FSH utilizada y la recuperación ovocitaria el día de la punción conjuntamente.

RESULTADOS

En el artículo publicado por Eric Van Royen et al. estudiaron, entre otros parámetros, la incidencia de multinucleación (definida como la presencia de al menos una célula con dos o más núcleos – ver figuras A, B y figuras 1, 2 –) en relación al número de ovocitos recuperados, la dosis de FSH total utilizada en la estimulación y la técnica de inseminación (FIV convencional vs. ICSI). Encontraron diferencias significativas en los casos en que se recuperaron 10 o más ovocitos por punción, así como las estimulaciones con dosis mayores o iguales a 2400 UI de FSH y en aquellos embriones con fragmentación mayor al 10%. La proporción de multinucleación en ICSI versus FIV fue de 1.06.

A partir de estos valores, tomándolos como punto de corte, analizamos la incidencia de MNC en nuestro centro, obteniendo los resultados presentados en la Tabla 1.

De un total de 3224 embriones obtenidos en 460 ciclos de FIV-ICSI realizados, observamos MNC en 376 embriones (11.7%), en 184 de los ciclos con uno o más embriones multinucleados (40.0%).

A partir del valor obtenido, establecimos como límite de normalidad para MNC en nuestro laboratorio los casos con menos de un 15% de embriones multinucleados. Observamos entonces para cada uno de los dos grupos (con mayor y con menor tasa de MNC de la esperada) la incidencia según la dosis de FSH utilizada durante la estimulación y, dentro de estos subgrupos, la incidencia en función del número de ovocitos recuperados. Según esto, no pareció observarse mayor MNC teniendo en cuenta sólo la dosis de FSH utilizada, pero sí se observó que la incidencia de MNC aumentó más de lo esperado en aquellos ciclos en que, usando una dosis > 2400UI de FSH, se recuperaron más de 9 ovocitos (75.9% comparado con un 46.7% esperado) (ver Tabla 1).

De un total de 1736 embriones con <10% de fragmentación, 198 presentaron MNC (11.4%), mientras que de los 1488 embriones con >10% de fragmentación, 178 presentaron MNC (12.0%), no apreciándose diferencias importantes entre los dos grupos.

Para las transferencias embrionarias, cuando era posible, se elegían aquellos embriones que más se aproximaban a los parámetros ideales de división: 4 células en Día 2, grado de fragmentación < 10%, con blastómeras simétricas y regulares y en los que no se hubiera observado MNC.

Así pues, cuando fue posible, no se eligieron embriones que hubieran presentado MNC dada su reducida tasa de implantación. A pesar de ello, en ocasiones se realizaron transferencias mixtas (embriones en los que no se observó MNC y embriones con MNC) dado que eran transferencias no selectivas (no había otros embriones para seleccionar).

De un total de 40 embriones con MNC transferidos correspondientes a 36 transferencias, se ha observado embarazo con saco en 13 ocasiones. En 12 de los casos, se trató de transferencias mixtas de embriones con y sin MNC; de estos 12 casos, 3 terminaron en aborto. En un caso, la transferencia fue de un solo embrión, el cual presentaba MNC; dio embarazo pero acabó en aborto de primer trimestre. Hubo dos casos de transferencias mixtas con embarazo bioquímico.

DISCUSIÓN

La MNC es un fenómeno habitual en los laboratorios de FIV y se ha correlacionado negativamente con las tasas de implantación, debiéndose tener en cuenta a la hora de decidir qué embriones transferir.

A partir de las observaciones realizadas en nuestro centro vemos que, en los casos en que es necesaria una estimulación con dosis elevadas de FSH (dosis mayores a 2400 UI pero recuperaciones ovocitarias de menos de 10 ovocitos), la incidencia de multinucleación no parece aumentar, pero sí parece hacerlo en casos en que, con dosis elevadas, la recuperación ovocitaria es también elevada. A partir de esta observación, valoramos que sería conveniente ajustar bien las dosis en la estimulación, de manera que en buenas respondedoras no se dieran altas dosis, ya que la recuperación ovocitaria, si bien fuera algo menor, sería suficiente para asegurar un buen ciclo de FIV en el que, probablemente, hubiera menor incidencia de multinucleación.

Es muy probable que la mayor incidencia de MNC en estos ciclos se deba a que muchos de los ovocitos recuperados no han tenido tiempo de madurar correcta y completamente durante el reclutamiento folicular, a pesar de que en muchos casos se puede observar la presencia de corpúsculo polar.

En lo que a tasas de gestación se refiere, no podemos sacar ninguna conclusión basándonos en nuestra experiencia, dado que sólo hemos realizado una transferencia con la totalidad de los embriones multinucleados (transferencia no selectiva de un solo embrión) o, en aquellas ocasiones en que se han realizado transferencias mixtas de embriones multinucleados junto con embriones sin MNC y se ha observado gestación, el número de sacos siempre ha sido inferior al número de embriones transferidos. Sólo hemos observado gestación evolutiva en dos de los casos correspondientes a transferencias mixtas, correspondientes a transferencias de tres embriones y embarazos gemelares. En dichos casos, no es posible asegurar cuál de los tres embriones no implantó, pero dada la baja tasa de embarazo descrita en embriones multinucleados, no es ilógico pensar que los embriones que presentaron MNC no fueron capaces de implantar, si bien no afectaron a la capacidad de implantación de los embriones que se transfirieron con ellos.

A la vista de los estudios presentados por tantos centros con respecto a la MNC y por nuestra propia experiencia, seguiremos considerando la presencia de MNC como un parámetro muy importante a la hora de decidir qué embriones son los más adecuados para la transferencia. Y, en la medida de lo posible, consideramos también muy importante ajustar los protocolos de estimulación a cada caso concreto para evitar su mayor incidencia.