CONCEPTO DE ESTRÉS TRADICIONAL Y MODERNO

El concepto de estrés ha adquirido considerable importancia en medicina humana ya que cada vez es mayor el número de personas que experimenta problemas, incluidos los de tipo reproductivo. En medicina veterinaria existe también una preocupación creciente (que es compartida por la población en general) por el bienestar animal que se ha traducido en la búsqueda de estrategias para contrarrestar los efectos negativos del estrés, tanto en animales domésticos en sistemas de producción, como en fauna silvestre mantenida en cautividad.

No existe un consenso universal en la definición de estrés ni tampoco en las variables que puedan medirlo de una forma objetiva. Frecuentemente se define como factores estresantes a todos aquellos que producen una alteración en la homeostasis. La correspondiente respuesta de defensa frente a esta agresión se conoce como mecanismo de respuesta frente al estrés. Hans Selye describió la respuesta orgánica común a todos los factores que causan estrés como un síndrome general de adaptación en el que se produce una respuesta primaria o de alerta a través de la activación del eje simpáticoadrenomedular con la liberación de catecolaminas (Ferin 2006). Posteriomente, se produciría una respuesta secundaria, de resistencia, que incluye la activación del eje hipotálamo-hipofisiario-adrenal y la liberación de corticosteroides de la corteza adrenal. Aunque algunos de los aspectos de la teoría acuñada por Selye siguen en vigor en la actualidad, el concepto de estrés ha ido evolucionando (para más información, ver McEwen y Wingfield 2003; Ferin 2006) y actualmente se acepta que la respuesta orgánica es específica para cada factor y que la respuesta de adaptación al estrés necesita de la participación y coordinación de vías neuroendocrinas centrales y periféricas (Ferin 2006). En condiciones prolongadas de estrés, funciones no esenciales como la reproducción pueden verse alteradas o inhibidas a favor de la supervivencia.

NIVELES EN LOS QUE LA REPRODUCCIÓN PUEDE VERSE AFECTADA POR LOS GLUCOCORTICOIDES

En general, está ampliamente aceptado que la reproducción se ve negativamente afectada por los efectos del estrés crónico, pero los efectos que el estrés agudo, o agudo repetitivo, podrían tener en la reproducción aún no están bien esclarecidos (Tilbrook et al. 2000). Los corticosteroides, la hormona ACTH y el estrés pueden tener efectos inhibitorios o, incluso, facilitatorios en la reproducción (Fig. 1) (Brann y Mahesh 1991; Sapolsky et al. 2000; Tilbrook et al. 2000). La reproducción femenina es más sensible a las alteraciones provocadas por el estrés que la masculina, debido a la sincronización que debe existir entre la secreción hormonal y los cambios morfológicos a todos los niveles del eje hipotálamohipofisiario- ovario y útero.

Existe abundante información que indica que los glucocorticoides afectan al eje hipotálamo-hipofisiario (Breen y Karsch 2006; Ferin 2006; Matteri et al. 2000; Vermeulen 2000). La mayoría de los factores que causan estrés inhiben la pulsatilidad tónica de la secreción de LH como resultado de la inhibición del generador de pulsos de GnRH o por cambios en la sensibilidad de las células gonadotropas a la estimulación por la GnRH (Ferin 2006). Las alteraciones frecuentemente observadas son la prolongación de la fase folicular, una fase lútea inadecuada y un pico preovulatorio de LH prematuro (Ferin 2006). Cuando las causas del estrés se cronifican o instauran pueden desarrollarse estados de hipogonadismo. En la mujer, el estrés psicogénico es el factor etiológico de la amenorrea funcional hipotalámica crónica, caracterizada por la supresión del ciclo menstrual e infertilidad y regresión del ovario a un estado similar al anterior a la pubertad. Esta amenorrea funcional hipotalámica está asociada a una secreción de cortisol elevada en comparación a mujeres con menstruación normal u otras causas de anovulación (Berga et al. 1997).

Sin embargo, la función gonadal podría verse afectada también de forma directa a nivel del ovario, tanto en la esteroidogénesis como en la oogénesis. El ovario es susceptible a la acción directa de los glucocorticoides; su acción está mediada por la presencia de receptores para glucocorticoides en las células ováricas (Schreiber et al. 1982; Tetsuka et al. 1999). Esta acción de los glucocorticoides en el ovario se encuentra modulada por la actividad de las 11b-hidroxiesteroidedeshidrogenasas (11b-HSD). Hay dos isoenzimas que regulan la acción fisiológica de los glucocorticoides catalizando la interconversión del cortisol/corticosterona (biológicamente activos) a sus respectivos metabolitos inertes (cortisona/11- dehidrocorticosterona). La isozima 11b- HSD 1 actúa predominantemente como una reductasa para incrementar la concentración local del cortisol, mientras que la 11b-HSD 2 actúa exclusivamente como una deshidrogenasa con elevada afinidad inactivando el cortisol (revisión en Michael et al. 2003).

El cortisol no se sintetiza de novo en el ovario (Omura y Morohashi, 1995) sino que se transporta desde las glándulas adrenales por la circulación sanguínea. La mayor parte del cortisol se transporta unido a proteínas plasmáticas y sólo una pequeña porción es libre y biológicamente activa. El cortisol se une principalmente a la proteína de unión a cortisol (CBP) o transcortina y con baja afinidad a la albúmina y a la proteína de unión a hormonas sexuales (SHBG) (Andersen 2002; Pugeat et al. 1981). Los niveles de cortisol libre en el fluido folicular son más elevados que en plasma (Andersen y Hornnes 1994; Harlow et al. 1997). Este incremento podría deberse al desplazamiento del cortisol de la proteína transportadora, transcortina, por parte de las altas concentraciones de progesterona y 17-a-OH-progesterona presentes en el fluido folicular de folículos preovulatorios (Andersen 2002).

RELACIÓN ENTRE EL METABOLISMO DE LOS GLUCOCORTICOIDES Y LA CONCEPCIÓN EN CICLOS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

En la especie humana podría existir una relación entre el metabolismo del cortisol y la probabilidad de concebir en ciclos de fecundación asistida (Michael 2003). La tasa cortisol:cortisona refleja la actividad enzimática de las 11b-HSDs modulando la interconversión de estos glucocorticoides y la concentración local de los mismos. Varios estudios han encontrado una asociación entre una tasa elevada de cortisol:cortisona intrafolicular (consistente con una baja actividad ovárica de 11b-HSD) y una mayor probabilidad de éxito en los protocolos de reproducción asistida (Keay et al. 2002; Lewicka et al. 2003; Thurston et al. 2003). Otros estudios no han encontrado una relación entre la concentración en el fluido folicular de cortisol, cortisona o la proporción entre ambos y el potencial de implantación de los embriones derivados de los tratamientos de fecundación asistida (Andersen et al. 1999). Sin embargo, en la especie porcina las enzimas 11b-HSDs actúan en el oocito y en las células del cúmulo inactivando los glucocorticoides, mecanismo que podría ser importante para limitar posibles efectos negativos durante la maduración del oocito (Webb y Michael, 2006). Un estudio reciente ha demostrado que la inactivación del cortisol por parte de las 11b-HSDs en las células de la granulosa en el cerdo incrementa a medida que el folículo se desarrolla y esta inactivación del cortisol está reducida de forma significativa en los quistes foliculares ováricos, implicando al cortisol en el crecimiento folicular y en el desarrollo de quistes (Sunak et al. 2007).

El éxito de los tratamientos de reproducción asistida puede verse afectado por el estrés asociado a la aplicación de estas técnicas. En la especie humana la fecundación in vitro (FIV) o inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) son técnicas que generan ansiedad y sus resultados pueden verse afectados. Así, se ha observado que los niveles de adrenalina en el momento de la recuperación de oocitos y las concentraciones de adrenalina y noradrenalina en el momento de la transferencia de embriones fueron más bajos en mujeres en los que el ciclo de FIV/ICSI fue exitoso que en las que no lo fue (Smeenk et al. 2005). Se ha asociado la vulnerabilidad al estrés con la FIV y transferencia de embriones, de tal forma que las mujeres que se someten a tratamientos de FIV y que presentan una mayor frecuencia cardiaca y presión arterial en respuesta al estrés, tienen un menor número de oocitos fecundables en comparación a las mujeres con respuestas menos exacerbadas (Facchinetti et al. 1997). Se ha observado igualmente en ciclos naturales, que el “distress” psicológico puede ser considerado como un factor de riesgo en el éxito de la concepción en mujeres con ciclos menstruales prolongados (Hjollund et al. 1999).

EFECTOS DIRECTOS DE LOS GLUCORTICOIDES EN LA ESTEROIDOGÉNESIS

La esteroidogénesis ovárica puede verse afectada por los glucocorticoides, cuyo efecto podría estar mediado por la alteración de la actividad de las enzimas que participan en su biosíntesis (Adashi et al. 1981; Schoonmaker et al. 1983). Estudios in vitro han mostrado que la dexametasona puede alterar la esteroidogénesis mediante la inhibición de la secreción de la LH (Huang y Li 2001) y que el cortisol inhibe la síntesis de pregnenolona estimulada por la LH (Michael et al. 1993). Ben-Rafael et al. (1988) encontraron un aumento en la producción de progesterona y estradiol por parte de las células de la granulosa, estimulada por el cortisol, pero a dosis suprafisiológicas.

EFECTOS DIRECTOS DE LOS GLUCOCORTICOIDES EN LA OOGÉNESIS

No se ha definido cuál es el papel del cortisol en el fluido folicular. Existe durante el pico de LH un incremento de los niveles de cortisol total y libre en el folículo (Andersen y Hornnes 1994; Harlow et al. 1997). Algunos estudios sugieren que el cortisol podría ejercer funciones en el desarrollo folicular y maduración del oocito (Fateh et al. 1989; Harlow et al. 1997) o que podría estar implicado en la respuesta antiinflamatoria tras la ovulación (Andersen 2002). En mujeres a las que se aplicaron tratamientos de estimulación ovárica con hormonas se encontraron niveles de cortisol más bajos en el fluido folicular de folículos que contenían oocitos inmaduros que en folículos con oocitos maduros (Fateh et al. 1989). De igual forma, la concentración de cortisol fue significativamente superior en los fluidos foliculares de folículos que contenían oocitos maduros que no se fecundaron que oocitos maduros que se fecundaron y dividieron (Fateh et al. 1989).

Podrían existir diferencias especie-específicas en lo que se refiere al efecto directo de los glucocorticoides y la maduración del oocito. En peces el cortisol parece estimular la maduración del oocito (Greeley et al. 1986). Estudios realizados en mamíferos sobre la influencia de los glucocorticoides en la oogénesis son contradictorios. Así, los estudios realizados in vitro en oocitos de cerdo han mostrado que la maduración se ve inhibida en forma tiempo- y dosis-dependiente (en un rango de 0.1-10 μg/ml) cuando los oocitos se exponen a la dexametasona o al cortisol (Yang et al. 1999). Sin embargo, la capacidad de los oocitos madurados in vitro de ser fecundados no se vio afectada por su exposición previa a la dexametasona (Yang et al. 1999). Este efecto inhibitorio no se produjo cuando se empleó el antagonista de receptores de glucocorticoides RU-486, lo que podría implicar al receptor de los glucocorticoides en procesos de reinicio y maduración del oocito (Yang et al. 1999).

Por otro lado, estudios realizados en ratón no mostraron efecto inhibitorio de los glucocorticoides (dexametasona, 1- 20 μg/ml y cortisol, 0.1-10 μg/ml) en la maduración de oocitos in vitro tanto en maduración espontánea como en la maduración inducida por FSH en presencia de hipoxantina (Andersen 2003).

El posible mecanismo de acción de los glucocorticoides sobre el oocito no se conoce. El efecto inhibitorio de los glucocorticoides encontrado en el estudio de Yang et al. (1999), ha sido parcialmente atribuido a la reducida cantidad del complejo p34cdc2-ciclina B1 (MPF, factor promotor de la meiosis) (Chen et al. 2000), complejo clave en la regulación del ciclo celular en el oocito (Abrieu et al. 2001).

En un estudio reciente en ratón se ha evaluado el efecto de la dexametasona en un bioensayo a nivel folicular, evaluando la foliculogénesis, la producción de esteroides, la oogénesis y la calidad del oocito. Este trabajo reveló una ausencia de efecto de la dexametasona, cuando se empleó a concentraciones de hasta 40 μg/ml, en la foliculogénesis y oogénesis. Cuando se empleó una concentración de 80 μg/ml la dexametasona impidió la diferenciación folicular y maduración del oocito (Fig. 2). La esteroidogénesis se vio afectada a partir de una concentración de 5 μg/ml y el desarrollo embrionario temprano a partir de 10 μg/ml (Fig. 3) (Van Merris et al. 2007).

Estos estudios sobre el papel directo de los glucocorticoides en la oogénesis han mostrado que el efecto negativo potencial de los glucocorticoides se observa a dosis relativamente elevadas fuera del rango fisiológico, al menos in vitro, por lo que es probable que este efecto sea más farmacológico que fisiológico. Sin embargo, es necesario evaluar el efecto directo de los glucocorticoides sobre la oogénesis in vivo. Además, en casos de perturbación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal que conlleven una producción elevada de glucocorticoides, se pueden producir disrupciones en el ciclo reproductivo y la función ovárica, alterándose el ambiente folicular en el que el oocito madura. Si el ambiente folicular no es adecuado, la competencia del oocito puede verse afectada negativamente repercutiendo en su capacidad posterior para generar embriones de calidad.

ESTRÉS Y REPRODUCCIÓN ASISTIDA EN ANIMALES SILVESTRES EN PELIGRO DE EXTINCIÓN

En los últimos años se ha producido un aumento en la preocupación por el bienestar animal y por los efectos que las prácticas de manejo tienen en los animales domésticos e igualmente por las condiciones en las que se mantienen y manejan a los animales silvestres en cautividad. El estrés de manejo y miopatía de captura son consecuencias importantes y frecuentes en animales salvajes. Puesto que las situaciones estresantes podrían alterar el correcto funcionamiento de cada componente del eje hipotálamo-hipófisis-ovario, la reproducción puede verse afectada (ver Dobson y Smith 2000; Dobson et al. 2001).

La reproducción natural de animales salvajes en cautividad se encuentra limitada y el estrés está considerado como uno de los factores que contribuyen a esta reducida reproducción (Hutchings et al. 1996; Zhang et al. 2004; Swaisgood et al., 2006).

Las tecnologías reproductivas tienen un gran potencial en su posible aplicación en especies de fauna amenazada. El éxito de las biotecnologías reproductivas es aún muy limitado en estas especies (Comizzoli et al. 2000; Pope 2000; Pukazhenthi and Wildt 2004) por numerosas causas entre las que se podrían destacar el desconocimiento general de la fisiología reproductiva de la mayoría de los animales salvajes, el escaso número de animales disponibles para la realización de estudios o la deficiente calidad del material obtenido para investigación. Además, el estrés derivado de las condiciones de cautividad y la mayor susceptibilidad de las especies salvajes al manejo intensivo suponen un factor adicional que contribuye al reducido éxito obtenido en estas especies.

El estrés inducido durante el manejo asociado a los tratamientos de reproducción asistida en muflones (Ovis musimon) podría contribuir a la reducida respuesta ovárica obtenida tras la superovulación. Además, la alta incidencia de regresión lútea temprana en hembras de muflón podría estar también asociada en parte al estrés repetitivo por la inmovilización de los animales durante los tratamientos (Ledda et al. 1995). El estrés de manejo se ha descrito como limitante en la aplicación de biotecnologías reproductivas en bisonte americano (Bison bison) (Dorn 1995). En nuestro trabajo de obtención de oocitos inmaduros mediante “ovum pick-up” por laparotomía, para su posterior maduración y fecundación in vitro en la gacela Mohor (Gazella dama mhorr), una de las hembras tuvo que ser retirada del experimento por estrés de manejo durante las capturas repetidas para la administración de FSH. Además, la respuesta general de las hembras de gacela al tratamiento de superovulación con FSH fue en general reducida (Berlinguer et al. 2008). El efecto del estrés asociado a las capturas repetidas durante el tratamiento hormonal, podría ser una causa que haya contribuido en parte a la limitada respuesta a la estimulación folicular.

El hecho de que el estrés pueda tener efectos deletéreos en la reproducción subrayan la importancia de evitarlo, o al menos minimizarlo en todo lo posible, bien sea para facilitar la reproducción natural o para aumentar las posibilidades de éxito en las ocasiones en que se requiera la aplicación de biotecnologías reproductivas. La aplicación de tranquilizantes durante los citados procedimientos podría ser útil en la reducción del estrés de manejo, captura y contención en estas especies. Fernández-Arias et al. (2000) describió que el estrés de manejo durante los tratamientos asociados con protocolos de superovulación en cabra montés (Capra pyrenaica) puede conllevar un fallo completo en la tasa de fecundación. Estos autores encontraron que el tratamiento con tranquilizantes de acción prolongada permitió la superovulación de estos animales y la obtención de embriones con capacidad de desarrollo posterior (Fernández-Arias et al. 2000). En un estudio en muflones, la administración de decanoato de flufenacina permitió una mejora en la respuesta folicular tras la superovulación hormonal, además de facilitar la manipulación de los animales (Ptak et al. 2002). En un estudio reciente realizado por nosotros en gacela Mohor el uso de enantato de perfenacina durante la superovulación con FSH nos permitió mejorar las condiciones de manejo ya que los animales pudieron ser capturados a mano por los cuidadores y las hembras se mantuvieron más tranquilas haciendo que su manejo fuera más fácil y seguro. Además, en las hembras tratadas con el tranquilizante, el cortisol plasmático permaneció a niveles inferiores respecto a los controles durante los días de manejo más intenso (Fig. 4). Es importante señalar que las tasas de recuperación, fecundación y división no sólo no se vieron negativamente afectadas por la aplicación del tranquilizante de acción prolongada en el grupo de las gacelas donantes respecto al grupo control, sino que el porcentaje medio de maduración de los oocitos fue significativamente superior en el grupo tratado y la tasa de desarrollo embrionario fue ligeramente mayor en el grupo con tranquilizante, si bien las diferencias en este último parámetro no alcanzaron diferencias significativas probablemente por limitaciones en el número de animales disponibles para este estudio (González et al. 2008).

CONCLUSIONES

El estrés puede afectar el éxito reproductivo a distintos niveles. Los distintos factores que generan estrés afectan a la reproducción de forma indirecta a través de la reducción de gonadotropinas actuando a través del eje hipotálamo-hipofisiario, pero también pueden ejercer efectos directos a nivel del ovario alterando la esteroidogénesis y la oogénesis, pudiendo afectar finalmente a la competencia del oocito para su progresión en la meiosis y durante el desarrollo embrionario. La reducción del estrés asociado a los tratamientos de reproducción asistida tanto en medicina humana como en veterinaria puede conducir a una mejora en los resultados obtenidos tras la aplicación de biotecnologías reproductivas.

AGRADECIMIENTOS

RG ha disfrutado de una beca del programa I3P-CSIC. La financiación para el desarrollo de nuestra investigación ha provenido de los proyectos REN 2003- 01587, CGL2006-13340/BOS y Acciones Integradas (HI20030336) del Ministerio de Educación y Ciencia.