IMPLICACIÓN DEL SISTEMA UBIQUITINA-PROTEOSOMA (UPS) EN LA CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA

Laura Abril Parreño

 

Introducción

La evaluación microscópica es una piedra angular del análisis del semen en la andrología humana, proporcionando información útil de la muestra de semen. Sin embargo, las pruebas convencionales se basan en la evaluación subjetiva de las características de los espermatozoides y tienen un limitado valor pronóstico de los resultados de fertilidad. Además, algunos casos de infertilidad masculina pueden ser diagnosticados erróneamente como idiopáticos, ya que ciertos tipos de anormalidades espermáticas suceden a nivel molecular, a veces con ausencia de manifestaciones morfológicas. Para abordar este problema, se recurre a la identificación de biomarcadores de la calidad espermática y su posible relación con la baja calidad del semen y la reducción de la fertilidad.

Concretamente en este estudio nos centramos en el análisis de la implicación del sistema ubiquitina-proteosoma (UPS) en espermatozoides de humano, ya que como es sabido los espermatozoides de los mamíferos, con un defecto visible u oculto, adquieren ubiquitina en su superficie durante la maduración en el epidídimo (Sutovsky et al., 2001a, Sutovsky et al., 2001b) para posteriormente ser eliminados. Sin embargo, algunos de estos espermatozoides consiguen llegar al eyaculado al fallar los mecanismos para su eliminación.

Para el establecimiento de la ubiquitina como un biomarcador de infertilidad humana, Sutovsky et al., (2004) realizaron un estudio, en el cual examinaron la relación entre el contenido de ubiquitina en espermatozoides y los parámetros clásicos de un espermiograma, en varones clínicamente infértiles por diferentes etiologías. Sus resultados mostraron que los pacientes infértiles (n=28) tenían valores altamente significativos de espermatozoides ubiquitinados, por lo que concluyen que el incremento de ubiquitinación está inversamente relacionado con la concentración espermática, la motilidad y el porcentaje de anormalidades morfológicas. Estos resultados sustentan el uso de la ubiquitina como un biomarcador de calidad del semen humano y sugieren su uso en otras especies (Sutovsky et al., 2004).

Por tanto, cabe esperar una relación entre parámetros de calidad espermática y estado del ADN con la presencia de ubiquitina en la superficie espermática mediante citometria de flujo.

Materiales y métodos

Las muestras de semen fueron obtenidas de 24 pacientes de la clínica Genetika (Pilsen, República Checa). En primer lugar, según la V Edición del manual de la Organización Mundial de la Salud (OMS), calculamos la concentración espermática y la motilidad de cada una de las muestras en la cámara Makler.

Citometría de flujo

Tras medir la concentración y motilidad de cada muestra mediante microscopía, se evaluaron la actividad mitocondrial (Mitotracker/YoPro-1) y la fragmentación del ADN (Ensayo de la estructura cromatínica del espermatozoide (SCSA)) mediante citometría de flujo. El resto de muestra se dividió en dos (una parte para el control negativo). Ambas partes fueron resuspendidas con medio Biggers-Whitten-Whittingham (BWW) y centrifugadas, para después ser fijadas con paraformaldehído al 4% durante 15minutos. Posteriormente fueron lavadas con PBS-NAN3 (suplementado con suero de cabra al 1%) y bloqueadas con este mismo suero al 5%.

A continuación, las muestras fueron incubadas con el anticuerpo Anti-Ubiquitina conjugado con FITC (DyLightR 488, Abcam) a una concentración de 1/100 durante 60 minutos. Mientras que los controles negativos no se incubaron con dicho anticuerpo. Finalmente, las muestras fueron lavadas, resuspendidas en PBS y analizadas mediante citometría de flujo (BD FACS Verse, Becton Dickinson).

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS v. 22 (SPSS Inc, Chicago, III). Se consideraron diferencias significativas cuando P ≤ 0.05. Se estudiaron las correlaciones entre los diferentes parámetros espermáticos evaluados. Además, para el estudio de las diferencias entre parámetros espermáticos en diferentes grupos de muestras (según su bajo o medio-alto %DFI y su bajo o alto %HDS) se utilizó un modelo mixto lineal donde el individuo fue considerado como efecto aleatorio.

Resultados

Las población de estudio consistió en 24 pacientes, de los cuales se obtuvo información de los parámetros espermáticos, actividad mitocondrial, estado del ADN y porcentaje de espermatozoides ubiquitinados. El porcentaje de espermatozoides ubiquitinados no fue significativamente correlacionado con los parámetros de calidad espermática como la concentración espermática (r= -0,329; P= 0,117) y motilidad progresiva (r= -0,215; P=0,314). Tampoco se encontró una correlación significativa con la actividad mitocondrial, en concreto para nosotros los espermatozoides de interés son aquellos viables con actividad mitocondrial (Mitotracker+/YoPro-1-) (r= -0,151; P= 0,491).

Además, no fue significativa la correlación observada entre el índice de fragmentación de ADN (%DFI, Dna Fragmentation Index) que se corresponde con el porcentaje de espermatozoides con alto daño en el ADN y la media de intensidad de fluorescencia de la ubiquitina ( r=0,060 ; P= 0,468). Tampoco se observó una correlación significativa entre la media de intensidad de fluorescencia de la ubiquitina y el porcentaje de células espermáticas inmaduras (%HDS, High Dna Stainability), ( r= 0,096 ; P= 0,698).

Pero hemos de destacar que cuando las muestras se agruparon teniendo en cuenta su bajo o medio-alto %DFI, aunque no se encontraron diferencias respecto al porcentaje de espermatozoides ubiquitinados, sí se encontraron diferencias significativas entre grupos de muestras para el porcentaje de espermatozoides no progresivos (P= 0,008). Del mismo modo, cuando las muestras se agruparon en función de su bajo o alto %HDS, se observaron diferencias significativas entre grupos para los espermatozoides con motilidad progresiva (P= 0,041); aquellos con motilidad no progresiva (P= 0,014); y con los espermatozoides viables con actividad mitocondrial (P= 0,039). Tampoco encontramos diferencias significativas para el porcentaje de espermatozoides ubiquitinados entre grupos de muestras con diferente %HDS.

Sin embargo, tendríamos que analizar también la correlación entre el porcentaje de ubiquitinación y la tasa de fecundación de cada una de las muestras, las cuales nos serán cedidas por la propia clínica en los próximos meses.

Discusión

Por tanto, teniendo en cuenta el pequeño tamaño muestral (n= 24) y nuestras condiciones de análisis (ubiquitina en la superficie espermática evaluada mediante citometría de flujo), la ubiquitina no es buen indicador de calidad espermática.

Por ello, para concluir un resultado robusto necesitaríamos mayor tamaño muestral y obtener los datos de fecundación de la clínica. Ya que según muchos estudios, la citometría de flujo si es una buena herramienta para valorar la calidad seminal ya que la medida de información es objetiva, rápida ya que se miden miles de células por muestra, automática y robusta estadísticamente para la obtención de niveles relativos de biomarcadores en las muestras de semen humano. Aunque debemos de tener muy presente que aunque esta técnica ofrezca la ventaja de poder medir biomarcadores la muestra no se puede utilizar clínicamente.

Por ello, es importante plantearse el siguiente paso en el análisis seminal con técnicas no invasivas como los microfluidos, espectroscopia RAMAN o selección celular inmunomagnética (MACS) de los espermatozoides como hacemos hincapié en una revisión que realizamos durante la presente estancia y que actualmente está aceptada y pendiente de su publicación (Štiavnická M, Abril-Parreño L, Nevoral J, Kraličkova M, Garcia Álvarez O. Non-invasive approaches for epigenetics-based sperm selection. Med Sci Monit 2017, in press. IF = 1.403).