Introducción: La tecnología de trasplante nuclear se ha aplicado para la mejora de la calidad citoplasmática ovocitaria y para la sustitución mitocondrial completa por spindle transfer.  En este contexto, presentamos una nueva aplicación: la generación de embriones androgenotas como una nueva posibilidad para la clonación del gameto paterno. Metodológicamente se basa en la microinyección espermática en ooplastos (ovocitos MII previamente enucleados), cuya ulterior activación permite el desarrollo mitótico uniparental. La validación de este modelo experimental pasa por su caracterización genética (ploidía, formula cromosómica y fingerprinting). Adicionalmente, el modelo permite explorar un sistema de edición genómica basado en CRISPR-Cas9 para corregir variantes patogénicas de origen espermático.

Objetivo: Validación del modelo androgenota mediante caracterización genética (ploidía, formula cromosómica y fingerprinting). Adicionalmente, empleando el modelo androgenota, se explora un sistema de edición genómica basado en CRISPR-Cas9 para corregir variantes patogénicas de origen espermático.

Materiales y métodos: Se generaron embriones androgenotas a partir de un paciente heterocigoto para la variante patogénica c.27dupG en el gen HBB responsable de la beta-talasemia y homocigoto para el polimorfismo c.9T>C en el mismo gen. El estudio genético de los androgenotas se realizó en día 3, analizando la ploidía (serie 1; n=6), fórmula cromosómica mediante aCGH (serie 2; n=6) e identidad genética por estudio de polimorfismos STRs (serie  3; n=18), destinando en las fas serie 2 y 3 al menos una célula para control de ploidía mediante FISH. La edición del genoma espermático se realizó coinyectando el espermatozoide con una mezcla de g-RNA, una secuencia de ADN donante de cadena sencilla y CRISPR-Cas9 durante la ICSI. En día 3, los androgenotas fueron analizados por secuenciación para las variantes del gen HBB (serie 4 n=32).

Resultados: Serie 1: Cada androgenota analizado mostró homogeneidad intra-androgenota en términos de ploidía, con fórmulas 23,X y 23,Y (1:1). Serie 2: El estudio de NGS en androcitos hermanos mostró fórmulas cromosómicas euploides uniformes en 76.2% de los androgenotas, mientras que el 23.4% de los androgenotas fueron no uniformes, presentándose en mosaico (aneuploide/euploide;  aneuploidías equilibradas). Serie 3: En total, 86% de los androgenotas mostraron fórmulas haploides 23X o 23Y. Cerca de la mitad de los androgenotas (52,3%) fuero portadores de la variante no patogénica para el alelo HBB y el 47,1%, portadores de aquélla patogénica. Además, el análisis individual de los androcitos constituyentes sugiere la existencia de isogenicidad intra-androgenota. El análisis de 18 androcitos demostró dicho evento, no observándose quimerismo intra-androgenota en ningún caso.

Dieciséis androgenotas con información genética completa (ploidía, fórmula cromosómica y estudio de genotipado para HBB) nos permite identificar a posteriori 7 androgenotas haploides con el genotipo no patogénico para el alelo HBB, haploides 23X o 23Y (3:4) sin aneuploidías y presentando el polimorfismo c.9T>C polymorphism.

Serie 4: Tras la coinyección del gRNA, sc-DNA y CRISPR-Cas9 con el espermatozoide, 3/32 androgenotas mostraron c.27dupG (9,4%), siendo 90,6% (29/32) no portadores de la variante patogénica en HBB; un porcentaje llamativamente superior a los controles (52,2%). Tras la secuenciación, observamos 3 grupos de respuesta, en relación a la edición: deleciones (25%), edición ineficiente (polimorfismo c.9T>C persistente; 50%) y edición eficiente (25%).

Conclusión: Los androgenotas mostraron la existencia de isogenicidad y autodiploidización, sugiriendo su sentido como tecnología de clonación gamética. El estudio de regiones génicas permitió establecer la segregación de variantes concretas, pudiendo corregirse mediante técnicas de edición genómica y rindiendo células únicas haploides y reparadas, aun con baja eficiencia dados los efectos off-target. Este trabajo presenta un modelo para el estudio del gameto paterno y abre la puerta a la generación preconcepción de células haploides analizadas y/o corregidas, procedentes de varones portadores de enfermedades monogénicas.