INTRODUCCIÓN

Una vez que se completa el proceso de espermiogénesis, los espermatozoides se desprenden de los complejos túbulobulbares de las criptas de la célula de Sertoli, pasando a la luz de los túbulos seminíferos mediante el llamado proceso de espermiación. Si durante los estadios inciales de la espermatogénesis, las meiosis I y II van a determinar la composición cromosómica de los espermatozoides, el proceso de espermiogénesis va a determinar la configuración fenotípica o morfológica del espermatozoide. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en otras especies de mamíferos, como es el caso de la rata, la espermiogénesis en el hombre es altamente ineficaz, de tal forma que por criterios estrictos de morfología de la OMS, se considera normal que el 85% de los espermatozoides liberados a los túbulos seminíferos sean morfológicamente anormales. Si bien todavía no se conocen los mecanismos moleculares que regulan el extenso remodelado citoplasmático y nuclear que las espermátides experimentan durante el proceso de espermiogénesis, se sabe que en la rata existen 19 steps o pasos de diferenciación celular, mientras que en el hombre únicamente existen 8. Dado que estos pasos funcionan como un sistema de control de calidad, ello podría explicar, al menos en parte, la relativa ineficacia de la espermiogénesis en el hombre y por qué en la rata el 95% de los espermatozoides producidos son morfológicamente normales. Una de las consecuencias más importantes de esta deficiencia biológica en el hombre es que la mayoría de los espermatozoides liberados a los túbulos están constituidos por subpoblaciones de espermatozoides inmaduros en diferentes estadíos de diferenciación debido a una maduración incompleta. Una de estas subpoblaciones está formada por espermatozoides inmaduros con retención proximal de citoplasma, que producen niveles elevados de radicales libres (ROS) (Gil-Guzmán et al., 2001). Este citoplasma residual debería haber quedado retenido en los complejos tubulobulbares de las criptas de la célula Sertoli, donde una vez fagocitado por esta célula, sería digerido en la zona basal de la misma. Dado que espermatozoides maduros e inmaduros se  encuentran en íntimo contacto durante las dos semanas que suele durar su transporte desde los túbulos seminíferos al epidídimo, en aquellos pacientes de infertilidad en los que la proporción de espermatozoides inmaduros con retención proximal de citoplasma sea relativamente alta, habría un mayor riesgo de que se produzca daño oxidativo a nivel de las membranas, citoesqueleto, enzimas y DNA. Esto pudiera resultar en pemeabilización de la membrana plasmática, con la consiguiente necro-astenozoospermia, daño de acrosoma, daño de centriolos, daño de fosfolipasa Czeta (que es el factor de activación del ovocito) y fragmentación del DNA. Cuando este daño es inducido de forma iatrogénica durante la preparación del semen, se le conoce como disfunción espermática iatrogénica (Mortimer,200).

La presencia de estas subpoblaciones de espermatozoides maduros e inmaduros en el semen va a ser de gran relevancia en la elección de los métodos que se van a utilizar en la preparación de los espermatozoides para técnicas de reproducción asistida (TRA).

Una vez que los espermatozoides llegan a la cola del epidídimo, van a ser almacenados aquí durante un período variable de tiempo hasta que se produzca la eyaculación. Durante ésta, la secreción de las vesículas seminales, de la próstata y de las glándulas de Cowper (líquido seminal) va a diluir el concentrado de espermatozoides que proviene de la cola del epidídimo y de la ampolla deferencial. El líquido seminal contiene una serie de factores que van a regular la función de los espermatozoides antes de su entrada en el útero. Como es bien sabido, los espermatozoides de mamíferos, incluyendo el hombre, una vez eyaculados son incapaces de fecundar el ovocito sin antes experimentar un proceso de maduración final conocido como “capacitación espermática”. La capacitación consiste en una cascada de reacciones bioquímicas que se inician con la salida de colesterol de la membrana y la formación de los llamados lipid rafts, y que confluyen en la fosforilación de residuos de tirosina en proteínas flagelares, la expresión de fosfatidilserina en la zona apical de la cabeza y un aumento de la concentración de NADPH (de Vries et al., 2003; Travis et al., 2004). La capacitación es esencial tanto en fertilización in vivo como in vitro y por ello es necesario capacitar a los espermatozoides cuando se va a realizar FIV convencional. El líquido seminal, además de factores decapacitantes como el colesterol, que inhiben la capacitación espontánea de los espermatozoides tras la eyaculación, también contiene otros factores que pueden interferir con la penetración del moco cervical, la reacción acrosómica in vitro y el proceso de fertilización. El contacto con el líquido seminal por un periodo superior a los 30 minutos post-eyaculación puede disminuir de forma permanente la capacidad fertilizante de los espermatozoides in vitro y, por otra parte, la contaminación de una mínima cantidad de líquido seminal en espermatozoides procesados puede inhibir su capacidad fecundante. Por lo tanto, los espermatozoides que se vayan a utilizar en inseminación intrauterina o en FIV convencional deberían de ser aislados del líquido seminal, no sólo lo antes posible después de la eyaculación y licuación del semen, sino también lo más eficientemente posible. En los laboratorios de andrología y de FIV, esta necesidad se manifiesta como el sperm washing o separación de los espermatozoides del líquido seminal y su resuspensión en un medio de cultivo isotónico.

¿Puede la centrifugación del semen dañar a los espermatozoides?

En términos físicos, la centrifugación pudiera ser perjudicial para los espermatozoides pero esto no parece afectar la función espermática hasta que no se alcanzan fuerzas gravitatorias por encima de las 800g (Jeulin et al., 1982). Sin embargo a finales de los años 80 se descubrió que el pelleting o “co-centrifugación” de las subpoblaciones de espermatozoides presentes en el semen, a las que hacíamos referencia antes, con frecuencia resulta en daño oxidativo significativo, que pudiera afectar de forma irreversible la función espermática in vitro (Aitken and Clarkson, 1988). Una revisión posterior pone de manifiesto el impacto potencial de este proceso sobre la función de los espermatozoides in vitro, indicando que los métodos de preparación del semen que incluyen un paso previo de centrifugación pueden interferir con la función espermática y disminuir la tasa de fertilización, o incluso resultar en fallo de fertilización en casos más extremos (Mortimer, 1991). La conclusión de estos estudios fue que se debería abandonar la práctica de métodos de preparación del semen que incluyan la centrifugación previa del mismo y pasar a utilizar métodos de preparación más seguros. Si bien estos estudios demostraron la existencia del daño inducido por ROS, ninguno examinó en profundidad el llamado proceso de disfunción espermática iatrogénica derivada de una preparación del semen no segura (Mortimer, 2000).

Nuestro conocimiento de los mecanismos a través de los cuales los leucocitos y los espermatozoides inmaduros producen ROS e inducen daño oxidativo en espermatozoides maduros (Ollero et al., 2001) nos proporciona una explicación mecanística del problema de disfunción espermática iatrogénica. Obviamente, no va a afectar a todos los pacientes por igual, especialmente a aquellos con parámetros seminales normales. Sin embargo, la gran mayoría de pacientes que acuden a clínicas de in vitro, dada la mala calidad de su semen, estarían expuestos a un mayor riesgo de daño iatrogénico durante la preparación del semen para TRA. Por lo tanto, la conclusión antes planteada sigue siendo válida en el sentido de que las técnicas de preparación de espermatozoides que incluyan el paso previo de la centrifugación del semen, en el cual éste se diluye con medio de cultivo, se centrifuga y el pellet se cubre con medio de cultivo, como se hace en la técnica swim-up estándar, ha de ser reconocido como potencialmente perjudicial y a veces letal para los espermartozoides así preparados. Métodos alternativos de preparación tales como el swim-up directo del semen licuado, ciertos métodos de adherencia y la centrifugación por gradientes de densidad, deberían de ser prioritariamente utilizados en la preparación de espermatozoides para TRA.

Excepciones a esta regla serían casos de oligospermia y astenozoospermia severa y muestras de semen contaminadas o potencialmente contaminadas con VHC y VIH, en los que el realizar un gradiente sería desaconsejable, y sí hacer un paso previo de dilución y centrifugación del semen.

Métodos seguros para la preparación del semen

Si bien la eficacia de un método de preparación de espermatozoides se suele medir por la concentración de espermatozoides móviles totales recuperados (REM), es importante también asegurarse de evitar o minimizar la presencia de microorganismos derivados del semen y la exposición a otros factores iatrogénicos. Otras consideraciones a la hora de seleccionar el método de preparación incluyen la complejidad técnica, los materiales usados, el aparataje, el tiempo y los costos. Además de estos requisitos, también hay que tener en cuenta que en un laboratorio de FIV con una sobrecarga importante de ciclos, hay que evitar, en la medida de lo posible, métodos de alta complejidad.

Swim-up directo del semen

La técnica del swim-up directo del semen es la técnica del swim-up originalmente utilizada en los años 50 en estudios de fisiología espermática. En este método, utilizando una aguja 19G conectada a una jeringa, alícuotas de 0,2-0,25ml del semen licuado se depositan en la parte inferior de tubos Falcon (de fondo redondeado para aumentar la superficie de la interfase) que contienen 0,5-0,8ml de medio de cultivo, y se incuban a 37ºC durante 60 minutos. Los tubos se pueden inclinar de unos 20 a 45º durante la incubación para aumentar también así la superficie de la interfase. Este proceso se repite con el número de tubos que sea necesario, dependiendo del volumen de la muestra. A diferencia de lo que ocurre en el swim-up estándar, el colocar el semen debajo de la capa de medio de cultivo hace que se produzca una interfase mucho más nítida y mejora los resultados de forma significativa. Una vez finalizada la incubación, se aspiran unos 350μl del sobrenadante. A continuación se combinan las fracciones de los diferentes tubos, se diluyen con medio de cultivo, se centrifuga a 400g por 10 minutos y se resuspende en el volumen de medio deseado. Típicamente, el porcentaje de motilidad obtenido suele ser >95%. En algunos métodos de swim-up directo, de forma simultánea a la migración de células móviles a la capa superior, se produce una selección morfológica, como es el caso de los medios que contienen ácido hialurónico. el Sperm Select System (Select Medical Systems, Williston,VT, USA) emplea el swim-up directo del semen licuado a un medio que contiene hialuronato sódico. Se ha demostrado que este método de swim-up resulta en tasas de embarazos más altas en FIV convencional comparado con el swim-up directo estándar (Wikland et al., 1987). Si bien este estudio no pudo establecer si este aumento en las tasas de embarazo se debe a que no se utiliza el paso previo de centrifugación, al uso de hialuronato sódico o a ambos, un estudio posterior puso de manifiesto que los resultados obtenidos con el Sperm Select System fueron equivalentes a los obtenidos con el swim-up directo del semen y confirmó que este método es superior al swim-up estándar del pellet lavado (Sjoblom and Wikland, 1991). Más recientemente otros estudios han demostrado el efecto beneficioso del hialuronato en la función espermática (Huszar et al., 1990; Sbracia et al., 1997). Por lo tanto, la técnica de Sperm Select podría ser de especial utilidad en la preparación del semen para inseminación intrauterina (Zimmerman et al., 1994). A diferencia del swim-up directo del semen, en el swim-up estándar, muchos de los espermatozoides que se encuentran en los niveles inferiores del pellet, nunca van a a alcanzar la interfase con la capa del medio de cultivo, especialmente si se utilizan tubos Falcon cónicos.

Métodos de adherencia

Los métodos de adherencia están basados en el fenómeno del sticking-to-glass o “adherencia al vidrio” que muestran los espermatozoides no viables. Uno de estos métodos es el de las columnas de fibra de vidrio que se preparan rellenando pipetas Pasteur con fibras de vidrio, pasando 2ml de medio cultivo para condicionarlas y añadiendo 1ml de semen licuado. El efluente se diluye con medio de cultivo y se centrifuga a 400g durante 10 minutos. El uso de estas columnas elimina el debris, así como células aglutinadas y no viables (Paulson and Polakoski, 1997; Rhemrev et al., 1989). Otro método de adherencia es el de los glass beads o “bolas de vidrio” que también resulta en buenas recuperaciones de espermatozoides móviles (Daya et al., 1987). Otro método usado es el de las columnas de Sephadex (SpermPrep, ZBL, Kentucky, KA,USA). Sin embargo el uso de las columnas SpermPrep requiere un paso previo de dilución y centrifugación antes de poder ser utilizadas para separar espermatozoides del líquido seminal. A pesar de que hay pocos estudios que comparen la selección y competencia funcional de espermatozoides preparados mediante métodos de adherencia con otros métodos, como el swim-up directo y los gradientes de densidad, se ha encontrado que, si bien las columnas optimizadas de SpermPrep (SpermPrep II) (Zavos, 1991) no requieren un paso previo de centrifugación, resultan en una recuperación espermática más baja que estos otros métodos (Smith et al., 1995).

Los métodos de adherencia que no incluyen un paso previo de centrifugación del semen no deberían ser perjudiciales para los espermatozoides, si bien algunos métodos que emplean, por ejemplo, fibra de vidrio, no deberían ser utilizados en inseminación intrauterina, ya que las muestras así procesadas podrían contener fragmentos de estas fibras.

Gradientes de densidad

Estudios previos indican que si bien la silica coloidal produce una separación isopícnica, la capacidad fertilizante de los espermatozoides así obtenidos podría estar comprometida. No fue hasta el advenimiento de la silica coloidal recubierta con polivinilpirrolidona (PVP) en los años 70 (Pertoft´s coloide, a.k.a. Percoll) que este método se consideró de alguna utilidad. La silica recubierta con PVP se utilizó por primera vez en los años 80 y su uso prevaleció hasta la retirada del Percoll de la práctica clínica en 1996 por la compañía que lo producía (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Varias propiedades hacen que la silica coloidal sea ideal como gradiente de densidad para la selección de espermatozoides:

(1) No tiene efecto osmótico alguno cuando se añade el medio de cultivo, ya que es una sustancia mineral.
(2) Facilita la preparación de un medio con una gravedad específica alta, lo cual es de una gran importancia ya que los espermatozoides son células de una densidad elevada.
(3) Dado que es un coloide en lugar de una solución, tiene una viscosidad baja y no disminuye la sedimentación espermática.

A pesar de que algunos autores reportaron el uso de gradientes continuos, las aplicaciones clínicas actuales de los gradientes de densidad emplean de forma exclusiva gradientes discontinuos, generalmente preparados con 2 ó 3 capas (Mortimer, 2000). Si bien Percoll está basado en silica coloidal recubierta de PVP, sus sustitutos, PureSperm (Nidacon International AB, Goteborg, Sweden) y ISolate (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA) utilizan silica coloidal unida covalentemente a moléculas de silano (silanized silica). Por lo tanto, las características de estos coloides deberían de ser equivalentes a las de Percoll (Perez et al., 1997), y su utilidad clínica parece ser al menos tan buena o incluso mejor (Chen, and Bongso, 1999). Una de las diferencias más importantes es que si bien el Percoll se vendía como silica coloidal en una solución con un buffer inorgánico débil concentrado 10x para producir una solución isotónica de gradiente al 90%, PureSperm y ISolate se preparan en medio isotónico listo para su uso. En la actualidad existen otros productos en el mercado que usan sílica silanizada como el SpermGrad (Equipos Médicos Biológicos, Barcelona).

Recientemente, durante el desarrollo del producto ready-to-use de Nidacon International, PureSperm 40/80% se llegó a la conclusión de que no sólo la capa inferior de gradiente de 90% reduce de forma significativa la recuperación espermática comparado con el 80%, sino que otros factores como la preparación del gradiente el día anterior a su uso, la perturbación de la interfase entre las capas de coloide del 40% y 80%, la reducción del volumen de las capas y la reducción del diámetro del tubo, también pueden reducir de forma significativa la recuperación espermática (Morrell et al., 2000;2004).

El hidrocarburo iodinado iohexol (Nycodenz) y su forma dimérica iodixanol, también se han utilizado de forma satisfactoria como gradientes de densidad para el procesamiento del semen (OptiPrep and Accudenz, Nycomed Pharma, Oslo, Norway), si bien su actividad osmótica requiere que el medio del gradiente tenga diferente composición iónica a la de los medios de cultivo habitualmente utilizados para la preparación de espermatozoides en FIV (Mortimer, 2000). Por último, el arabinogalactan, un derivado vegetal, ha sido utilizado como gradiente de densidad para la preparación de espermatozoides bovinos (Ellington et al., 1996), y también para la preparación del semen humano bajo el nombre de IsoCare (In VitroCare: San Diego,CA, USA).

Gradientes de densidad: Método

Lo habitual es realizar gradientes de densidad discontinuos utilizando o bien la combinación de 40/80% de PureSperm (Nidacon International AB, Goteborg, Sweden) o la combinación de 45/90% de otros gradientes como ISolate (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) o SpermGrad (Equipos Médicos Biológicos, Barcelona). En el caso de PureSperm se recomienda usar volúmenes de 1,5ml en cada capa mientras que en el caso de ISolate y SpermGrad se recomiendan volúmenes de 1ml. Si bien se suele cargar primero la capa de mayor densidad y luego se añade encima lentamente la de menor densidad, el cargar primero la de menor densidad y añadir luego la de mayor densidad produce una mayor recuperación de espermatozoides móviles (Mortimer, 2000). Esto está basado en el hecho de que así se produce una interfase mucho más nítida. El volumen de la muestra a cargar puede variar entre 0,5 y 5ml si bien no se recomienda cargar más de 3ml. En caso de muestras viscosas se recomienda utilizar los nuevos vasos de licuación MARQ recientemente desarrollados (Laboratorios Romal). Una vez que se cargan las muestras del semen licuado, se centrifuga a 400g durante 20 minutos. Luego, se introduce una pipeta estéril a través de las capas, se extrae el pellet (50-100ml) y se transfiere a otro tubo Falcon. Algunos autores recomiendan aspirar primero las capas superiores antes de recoger el pellet (Mortimer 2000). A continuación se añaden 10 volúmenes de medio de cultivo y se centrifuga a 400g durante 10 minutos. Una vez finalizada la centrifugación, se aspira el sobrenadante y se resuspende el pellet en el volumen deseado de medio de cultivo.

En caso de muestras con parámetros normales de semen que van a ser utilizadas en TRA, también pueden utilizarse gradientes monocapa de 90%. En estos gradientes se añade 1ml de gradientes del 90% (ISolate o SpermGrad) a tubos Falcon, se carga encima la muestra y se centrifuga a 400g por 20 minutos, como en el caso anterior. Las recuperaciones que se obtienen son comparables a las que se obtienen con los gradientes habituales de dos capas. Los gradientes monocapa se recomiendan en la preparación de muestras de semen que van a ser utilizadas en ciclos de IAC.

Selección espermática: motilidad, morfología y genotipo

Cualquier método basado en la migración espermática va a producir una subpoblación de espermatozoides con una mejor morfología, basado en el proceso de distribución diferencial de defectos morfológicos entre la pieza intermedia y el flagelo en espermatozoides con morfología normal o anormal de cabeza (Mortimer, 1994a; 1994b). Este proceso es equivalente al que ocurre durante la penetración del moco cervical in vivo y refleja el proceso de selección natural, si bien este proceso de selección fenotípica o morfológica no necesariamente implica la selección de espermatozoides con un genotipo normal.

Existen muy pocos ejemplos en los que se demuestre que la morfología espermática, determinada por microscopía de luz, esté correlacionada con la calidad geonómica del espermatozoide. Las cabezas microcefálicas y macrocefálicas se asocian frecuentemente a aneuploidías y diploidías, y el locus t en ratones resulta en la producción de espermatozoides anormales. Otras asociaciones más específicas incluyen el síndrome de discinesia ciliar primaria y la globozoospermia, si bien los genes implicados en estas anomalías todavía no se conocen. Existen numerosas publicaciones sobre las diferencias morfométricas entre espermatozoides que portan un cromosoma X o un cromosoma Y, así como métodos para la separación de estas subpoblaciones. Sin embargo, si bien parece que existen diferencias de tamaño, estas son demasiado pequeñas para tener aplicación clínica alguna.

Todavía existe cierta preocupación sobre el hecho de que los espermatozoides microinyectados en ICSI no sufren el proceso de selección natural que ocurre in vivo, o incluso en FIV convencional. Esto podría resultar en un mayor índice de anomalías genéticas en el recién nacido. Sin embargo, esta supuesta relación entre espermatozoides anormales y anomalías genéticas es generalmente infundada, ya que se ha demostrado que espermatozoides morfológicamente anormales pueden aportar un cariotipo normal dando lugar a hijos sanos (Martin and Rademaker, 1988; Burruel et al., 1996), si bien también se ha demostrado que espermatozoides humanos y de ratón con una forma anormal de cabeza podrían portar más anomlías cromosómicas que los morfológicamente normales (Lee et al., 1996; Kishihawa et al., 1999). De todos modos, cuando el biólogo microinyecta espermatozoides en ICSI, habitualmente selecciona espermatozoides móviles que tienen una morfología de cabeza “aparentemente” normal, con las limitaciones que el uso de microscopía de contraste de fase para este fin supone. Además, sabemos que la concepción natural en parejas normales fértiles también puede dar lugar a embriones genéticamente anormales, muchos de los cuales podrían ser causados por aneuplodías o triploidías transmitidas a través de los espermatozoides. Sin embargo, si parece existir una relación entre concentración espermática, morfología y aneuploidías. En un estudio reciente, Burrello et al., demostraron que los espermatozoides morfológicamente normales de pacientes con oligospermia tenían un mayor índice de aneuploidías que espermatozoides morfológicamente normales de pacientes con normozoospermia (Burrello et al., 2004). Esto sugiere que durante el proceso de espermatogénesis, en aquellos pacientes donde existe un screening deficiente por parte de la célula de Sertoli a la hora de eliminar espermatozoides defectuosos, espermatozoides con un complementeo cromosómico anormal marcados para apoptosis podrían escapar este proceso de selección o screening y aparecer en el eyaculado. Sin embargo, el proceso de espermiogénesis, que es el que va a determinar la morfología espermática, sería normal en estos pacientes, dando lugar a espermatozoides morfológicamente normales pero aneuploides.

Si bien los gradientes de densidad producen un mayor yield o recuperación de espermatozoides morfológicamente normales que otros métodos de preparación del semen, hoy por hoy, no existen métodos de selección espermática que permitan separar y aislar espermatozoides con un genoma normal, de espermatozoides con un genoma defectuoso, ya sea por aneuploidías, fragmentación de DNA o modificaciones de nucleótidos. Un método desarrollado recientemente en esta dirección es el utilizado para separar espermatozoides apoptóticos de espermatozoides no-apoptóticos, mediante el uso de las columnas de ANnexin-conjugated MicroBeads (ANMB Microbead Kit, Miltenyi Biotec, Germany). El principio en el que están basadas estas columnas es que los espermatozoides apoptóticos expresan fosfatidilserina en la hemicapa externa de la membrana y se unen a la annexina V. Al aplicar un campo magnético a las columnas, los espermatozoides unidos a las anexinas V conjugada con las micropartículas magnéticas serían retenidos en la columna, mientras que los no-apoptóticos pasarían a través de la misma (Grunewald et al., 2001).

Radicales libres y fragmentación del DNA espermático

Los ROS en semen son normalmente producidos por leucocitos y/o espermatozoides inmaduros (Aitken, 1995; Whittington and Ford, 1999; Gil-Guzman et al., 2001). Los espermatozoides que producen los mayores niveles de ROS son los espermatozoides inmaduros con retención proximal de citoplasma y los espermatozoides con macrocefalia (Gil-Guzman et al., 2001). Esto parece estar relacionado con la presencia de protein kinasa C en estos restos citoplasmáticos, ya que la estimulación con ésteres de forbol aumenta de forma significativa la producción de ROS por estos espermatozoides (Gil-Guzman et al., 2001). Los espermatozoides con retención proximal de citoplasma, dada su menor densidad por su mayor contenido lipídico, quedan retenidos en las capas superiores menos densas y, por lo tanto, no se van a encontrar en el pellet del gradiente. Sin embargo, esto no ocurriría en el caso del swim-up, ya que espermatozoides móviles con retención proximal de citoplasma podrían migrar también hacia la capa superior. Esto reafirma una vez más la importancia del uso de los métodos “seguros” de preparación espermática, como los gradientes de densidad. Los ROS no solamente inducen daño a nivel de los fosfolípidos de membrana sino también a nivel del acrosoma y del DNA, dando lugar a modificaciones de nucleótidos tipo 8-OH-guanosina y 8-OH-2´-deoxiguanina, y a fragmentación de DNA de cadena doble (Sakkas et al., 1997; Evenson et al., 1999; Alvarez, 2003; Alvarez, 2005).

Una de las implicaciones de estos hallazgos es que pacientes con oligoastenoteratozoospermia tienen una mayor proporción de espermatozoides inmaduros en semen debido quizás a un proceso de espermiogénesis defectuosa, y por lo tanto estos espermatozoides están a un mayor riesgo de daño de DNA inducido por ROS. Por lo tanto, si estos espermatozoides se preparasen por simple dilución y centrifugación, habría un mayor riesgo de producir roturas del DNA espermático y dar lugar a embriones con un genoma defectuoso, lo cual a su vez podría conllevar a un desarrollo embrionario anormal una vez que el genoma del embrión se active (Shoukir et al., 1998). Si bien muchos laboratorios de in vitro utilizan gradientes de densidad de forma habitual en la preparación del semen, muchos laboratorios todavía siguen utilizando la dilución y centrifugación del semen para obtener espermatozoides para ICSI, ya que consideran que la disfunción espermática inducida por ROS no va a tener mayores consecuencias en ICSI. Sin embargo, esto no siempre es así. El efecto perjudicial de los ROS se ha puesto una vez de manifiesto en estudios recientes que sugieren que durante el transporte de los espermatozoides a través de los túbulos seminíferos y el epidídimo se puede inducir fragmentación del DNA espermático. Esto parece estar mediado por el radical hidroxilo producido por espermatozoides inmaduros. El hecho de que los espermatozoides estén altamente empaquetados en el epidídimo facilita que se produzca daño inducido por el radical hidroxilo, ya que su vida media es del orden de microsegundos y, por lo tanto, espermatozoides maduros e inmaduros tendrían que estar muy próximos unos de otros para que se produzca este tipo de daño. Lo mismo ocurriría en el pellet de un semen centrifugado donde los espermatozoides estarían también en íntimo contacto. En un estudio reciente, Greco et al, encontraron que el nivel de fragmentación de DNA en espermatozoides eyaculados, medido por la técnica de TUNEL, en un grupo seleccionado de pacientes oligospérmicos y normozoospérmicos, era significativamente mayor al encontrado en espermatozoides testiculares de estos mismos pacientes (23,6% vs 4,8%,P<0,001). Las tasas de embarazo obtenidas con espermatozoides testiculares fueron del 44,4% mientras que con espermatozoides eyaculados fueron del 5,6% (Greco et al. 2005). Esto avala la hipótesis de la inducción de fragmentación de DNA por ROS durante el transporte de los espermatozoides por los túbulos seminíferos y el epidídimo donde, como ya indicamos antes, los espermatozoides están altamente empaquetados, ocupando la mayor parte del diámetro de la luz del túbulo. En otro estudio similar, Steele et al., encontraron que el nivel de fragmentación en espermatozoides aislados del epidídimo era significativamente superior al de espermatozoides testiculares aislados de estos mismos pacientes (Steele et al. 1999).

A pesar de que el daño de DNA inducido por ROS es difícil de demostrar en ciclos de TRA, ya que el ovocito podría reparar este tipo de daño, y además normalmente no se miden los niveles de ROS en semen, uno de los principios fundamentales que deben guiar toda práctica médica es primum non nocere o, lo que es lo mismo, “primero no dañar”, como dice el antiguo aforismo hipocrático. Por lo tanto, los responsables de los laboratorios de in vitro deberían evitar, en la medida de lo posible, el uso de técnicas que se sabe son nocivas, sobre todo, si pueden utilizarse otras técnicas que son más seguras. Curiosamente, en Bruselas, donde se desarrolla la técnica de ICSI, se utilizan gradientes de densidad (Verheyen et al. 1999). Sin embargo, como habíamos indicado antes, excepciones a esta regla serían casos de oligospermia y astenozoospermia severa, y muestras de semen contaminadas con VHC y VIH, en los que el realizar un gradiente estaría obviamente desaconsejado, y si hacer dilución y centrifugación del semen.

Capacitación espermática y TRA

Una de las preguntas que con frecuencia se hacen los biólogos es ¿cuáles son las condiciones óptimas a las que mantener las suspensiones de espermatozoides después de su preparacíon, ya sea por gradientes de densidad, por swim-up u otros métodos, antes de ser utilizadas en TRA?

Si bien en España se habla de capacitación espermática una vez que se han recuperado los espermatozoides por swim-up o por gradiente, para que se produzca la capacitación espermática propiamente dicha se requieren los siguientes requisitos: (i) que el medio de cultivo contenga una concentración de CO₃H- de al menos 20mM; (ii) que contenga un mínimo de 10mg/ml de albúmina humana; (iii) que contenga una concentración de CaCl₂ de 1,5mM; (iv) y que las suspensiones de espermatozoides sean incubadas a 37ºC durante al menos 4 horas (Osheroff et al., 1999). La gran mayoría de los medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio de andrología y de in vitro tienen una composición iónica que se ajusta a estos requisitos. Lo habitual es colocar las suspensiones en el incubador de CO₂ a 37ºC después de haber sido procesadas. Sin embargo, dado que en la mayoría de los laboratorios de in vitro las muestras de semen se procesan a primera hora de la mañana, que las inseminaciones para FIV convencional o IAC, por regla general, se van a hacer unas horas más tarde, y que las muestras podrían “sobrecapacitarse” y como consecuencia decapacitarse, es muy importante ajustar bien el tiempo de intervalo entre la preparación de las muestras y su uso para TRA. Se sabe que en algunas pacientes, la capacitación puede producirse en tan solo 1 o 2 horas, mientras que en otros puede tardar 8 horas o más. Por lo tanto dado que la sobrecapacitación podría llevar a un “agotamiento bioquímico” de los espermatozoides con una defosforilación de proteínas flagelares, una caída en los niveles de NAPDH, y un aumento en la reacción acrosómica espontánea, en muestras que vayan a ser utilizadas en FIV convencional o IAC, se recomienda que una vez procesadas, sean incubadas a temperatura ambiente hasta 1 hora antes de realizar la técnica correspondiente, y después de este período, introducirse en el incubador de CO₂ a 37ºC. La mayor parte de los medios de cultivo utilizados en el laboratorio de andrología, además del buffer de CO₂H/CO₃H₂(CO₂ disuelto en H₂0) contienen tampones que permiten mantener el pH dentro de límites perfectamente tolerables por los espermatozoides (de 7,0 a 8,0) lo cual va a permitir que puedan incubarse a temperatura ambiente sin estar expuestos a una atmósfera de CO₂ al 5%. Una vez que se haga la FIV convencional, los espermatozoides van a disponer de tiempo suficiente para poder capacitarse in vitro. En el caso de la IAC, la capacitación va a tener lugar a nivel del istmo de las trompas.

Criopreservación del semen

Con frecuencia es preciso congelar muestras de semen en pacientes que van a realizar ciclos de IAC, in vitro y OVODON, o que van a ser sometidos a vasectomía o a tratamientos de quimio/radioterapia. A continuación se describen los protocolos recomendados para la congelación y descongelación del semen.

Congelación del semen

Una vez analizados los parámetros seminales en el semen licuado, éste se diluye 1:1, v/v con medio de congelación TEST-yolk buffer con glicerol (Irvine Scientific, Santa Ana, CA). Es muy importante que el medio de congelación se añada gota a gota lentamente durante un período de al menos 5 minutos, mezclando periódicamente. Esto facilita que se produzca un equilibrio osmótico eficiente sin que se altere la osmolaridad celular de forma brusca. En cuanto al número de viales a congelar, se recomienda dividir la muestra diluída con crioprotector en varios criotubos o pajuelas de 0,2 a 0,5ml (una media de 6 por paciente), tres para IAC (0,5ml) y 3 para ciclos de in vitro (0,2ml). Uno de los métodos habituales de congelación es exponer los criotubos o pajuelas a vapores de nitrógeno. La tasa de congelación ideal para la congelación se alcanza cuando la bandeja con los criotubos o pajuelas se expone a vapores de nitrógeno líquido a -70°C durante 15 minutos a unos 35 cm por encima de la fase líquida. A continuación se desciende la bandeja a 15 cm de la fase líquida durante otros 15 minutos. Finalmente, se sumergen en nitrógeno líquido (-196°C) (Mortimer, 1994a). Hay varios métodos alternativos de congelación. La diferencia  principal  entre estos métodos está en la rampa de congelación y no en los medios crioprotectores. Por ejemplo, uno de estos métodos, que se aplica exclusivamente a criotubos,  consiste en exponer los criotubos a 0°C durante unos 20 minutos, luego a -20°C durante 3 minutos, y a continuación sumergirlos en nitrógeno líquido. Para ello se va a necesitar de un frigorífico con la temperatura ajustada a OºC, de un  congelador ajustado a -20ºC y de tres sondas de temperatura con indicador digital. Dos de estas sondas se utilizan para monitorizar la temperatura del frigorífico y del congelador, y la tercera sonda se coloca en un criotubo control que contenga 0,5ml de crioprotector para monitorizar la temperatura en el criotubo durante la congelación. Una vez que las muestras se diluyen con el crioprotector, se dividen en los criotubos  correspondientes y los criotubos con las muestras y el criotubo control se colocan en el frigorífico a 0°C hasta que se alcance la temperatura de 4°C (rampa 1). Una vez que se alcance esta temperatura, se espera 1 minuto (rampa 2),y luego se transfieren al congelador a -20°C hasta alcanzar los 0ºC (rampa 3). Una vez que se alcance esta temperatura, los criotubos con las muestras se transfieren a nitrógeno líquido (rampa 4), ya sea en cajas o en varillas de aluminio (Mortimer, 2004). Si se dispone de un sistema automático de congelación programable, la rampa de congelación que se recomienda es muy similar al método manual antes descrito. Para el caso de criotubos, primero se pasaría de temperatura ambiente a 4°C con una tasa de congelación de -1ºC por minuto (rampa 1). Luego, se mantiene a 4°C durante 1 minuto  (rampa 2). A continuación, se utiliza una tasa de -2ºC/min hasta alcanzar 0ºC (rampa 3). Finalmente los criotubos se transfieren a nitrógeno líquido (rampa 4). En el caso de pajuelas, la  única diferencia es que la rampa 1 es de -5°C/min y la rampa 3 de -10°C/min hasta alcanzar -80°C.

Preparación de muestras IUI-ready

Además de la congelación estándar del semen, también se pueden congelar muestras de esperma preparadas por gradientes de densidad y tratadas con un medio de congelación que no con­tiene yema de huevo y que, por lo tanto, pueden ser inseminadas directamente después de su descongelación sin necesidad de ser procesadas (Mortimer, 2004). De ahí el nombre de IUI-ready o “listas para inseminación intrauterina”. Si bien la preparación de muestras IUI­-ready se aplica habitualmente a la congelación de muestras de semen de donante en bancos de semen, también podrían utilizarse en la preparación de muestras de pacientes que van a hacer ciclos de IAC y que por razones profesionales o de otro tipo no pudieran estar disponibles el día de la inseminación. Los bancos de semen más prestigiosos de EE.UU. y Europa ofrecen en la actualidad muestras IUI-ready para ciclos de IAD. Las tasas de embarazo que se obtienen con muestras IUI-ready son similares o incluso mejores a las que se obtienen con muestras de semen congelado estándar (Wolf et al., 2001).

Para la preparación de las muestras IUI-ready se carga 1 ml de semen licuado por tubo de gradiente PureSperm 40/80% (se carga primero la fase de 40% y luego la de 80%, como ya se describió anteriormente), se centrifuga a 400g por 20 minutos, se aspira el pellet y se resuspende en 10 volúmenes de medio de cultivo PureSperm Wash (Nidacon lnternational AB, Goteborg, Sweden). Luego se centrifuga a 400g durante 10 minutos y se desecha el sobrenadante. Al pellet resultante se le añaden de 0,45 a 0,70 ml de medio de cultivo PureSperm Wash y se mezcla bien. A continuación se añade gota a gota y lentamente de 0,5 a 0,75 ml, respectivamente, de medio de congelación CryoProtec (Nidacon lnternational AB, Goteborg,Sweden) durante un período de al menos 5 minutos. Luego se transfieren alícuotas de 0,5 ml a pajuelas o criotubos y se congelan siguiendo los protocolos previamente descritos pa­ra la congelación del semen.

Descongelación del semen

El método habitual de descongelación del semen consiste en incubar los criotubos o las pajuelas en un baño de agua a 37°C durante 5 minutos. Otros autores recomiendan hacer la descongelación a 37ºC en un incubador o en bloques de aluminio. Una vez finalizada la descongelación, las muestras están listas para su procesamiento. Esto puede hacerse bien a través de un swim-up o de un gradiente de densidad, si bien se recomienda hacer este último. Si se va a hacer un swim-up, lo habitual es transferir los 0,5 ml de cada criotubo o pajuela a tubos Falcon, centrifugar a 300g durante 10 minutos, desechar el sobrenadante y añadir al pellet 100 μl de medio de cultivo lentamente por la pared del tubo para no perturbar el pellet. Luego se incuba a 37°C durante 45 a 60 minutos. A continuación, se aspiran unos 75μl del sobrenadante y se combinan las diferentes fracciones.

La correcta dilución del semen congelado tras la descongelación es de vital importancia en la preparación de espermatozoides para TRA. Si bien en algunos laboratorios esto se hace de forma adecuada, todavía existen muchos laboratorios donde la dilución del semen se hace de forma incorrecta, sobre todo cuando se van a utilizar gradientes de densidad para su preparación. Una vez realizada la descongelación, antes de cargar la muestra, ya sea en la capa del 40% en el caso del gradiente 40/80% de PureSperm, en la capa del 45% del gradiente 45/90%, o en la capa del 90% del gradiente monocapa, se requiere que éste sea diluido de 5 a 10 veces con medio de cultivo isotónico. De lo contrario, se produciría un choque osmótico que haría que la recuperación de espermatozoides móviles fuese muy baja (Mortimer, 2004). Para ello, en casos habituales de pajuelas o criotubos de 0,5 ml, tras su descongelación, el semen con el crioprotector se transfiere a tubos Falcon y se añade gota a gota y lentamente 2 ml de medio de cultivo (dilución 5x) o 4,5 ml (dilución 10x) durante al menos 5 minutos para permitir que se produzca un equilibrio osmótico eficiente sin que se altere la osmolaridad celular de forma brusca. En general, la dilución 5x es suficiente. Una vez que se haya diluido, se cargan en cada tubo del gradiente los 2,5 ml del semen diluido de cada pajuela o criotubo y se centrifuga siguiendo el protocolo estándar (400g durante 20 minutos).

Criopreservación de espermatozoides epididimarios y testiculares

El advenimiento de ICSI y el perfeccionamiento de los protocolos de congelación para muestras de esperma, que en la era pre-ICSI no hubieran sido con­geladas, permite ahora la  criopreserva­ción rutinaria de espermatozoides epididimarios y testiculares, independientemente de la cantidad y calidad de los mismos. Existen una serie de ventajas obvias en la criopreservación de estas muestras de esperma: (i) no hay necesidad de hacer varias intervenciones quirúrgicas para obtener las muestras; (ii) la aspiración o extracción espermática puede llevarse a cabo en cualquier momento, antes de realizar la punción folicular,  facilitando así la disponibilidad del andrólogo y de las muestras; y (iii) las muestras de espermatozoides epididimarios y testiculares pueden ser obtenidas y congeladas durante el curso de una prueba diagnóstica o durante exploración escrotal para una recanalización de una vasectomfa (particularmente va­so-epididimostomía) o en casos de cicatrización inflamatoria epididimaria, cuando la cirugía reconstructiva fracasa.

Obtención y preparación de espermatozoides del epidídimo

Las indicaciones de la aspiración de espermatozoides del epidídimo suelen ser procesos obstructivos que se presentan con azoospermia. Estos procesos incluyen: ausencia bilateral del conducto deferente, fibrosis quística, vasectomía, fallo de reversión de una vasectomía, obstrucción inoperable de los con­ductos eyaculadores o del conducto deferente y prostatectomía radical. En casos de azoospermia no obstructiva, no se debe realizar la aspiración epididimaria, dado que el lumen suele estar colapsado y no se pueden obtener espermatozoides. Actualmente hay dos métodos que se utilizan para obtener espermatozoides epididimarios: la aspiración microquirúrgica de espermatozoides epididimarios (MESA) (Patricio et al., 1988) y la aspiración percutánea de espermatozoides epididimarios (PESA) (Craft et al., 1995). Si bien la mayoría de la literatura científica se ha centrado en la técnica de MESA, estudios recientes sugieren que la técnica de PESA ofrece una serie de ventajas como son el hecho de que es menos invasiva y menos costosa. La técnica de MESA se realiza normalmente bajo anestesia epidural y consiste en hacer una incisión longitudinal en el escroto de unos 2,5 cm de longitud hasta llegar a la túnica vaginal. Una vez que se expone el epidídimo, utilizando una magnificación de 6-40x con un microscopio de quirófano, se selecciona un túbulo epididimario del caput, se abre longitudinalmente el túbulo y el líquido resultante se recoge con un 22 Medicut acoplado a una jeringa de tuberculina, que contiene unos 100 μl de medio de cultivo para evitar que se seque la muestra obtenida del epidídimo. La muestra se pasa al/la biólogo/a para determinar si hay espermatozoides y si hay que seguir aspirando o bien hay que ir a otro túbu­lo epididimario. A veces hay que aspirar de los tubos eferentes (que unen la rete testis con el epidídimo). Si no se en­contrasen espermatozoides en los tubos eferentes, se indicaría hacer extracción de espermatozoides testiculares (TE­SE). En cuanto a la técnica de PESA, se hace una sedación simple, en la que el paciente está consciente, y/o un bloqueo anestésico del cordón espermático. Con una mano se inmoviliza el testículo mientras que se aspira con una aguja de 21, 22 o 23G, conectada a una jeringa de 20 ml insertada a través del escroto directamente dentro del caput proximal del epidídimo. Dado que hay que crear presión negativa, se necesita de un asistente para aspirar con la jeringa. Una vez que se obtiene fluido epididimario, se examina al microscopio para ver si hay espermatozoides móviles. El líquido epididimario puede contener desde miles de espermatozoides hasta unos 200 millones. Si no se encontrasen espermatozoides, habría que recurrir a hacer TESA o TESE.

Obtención y preparación de espermatozoides del testículo

Las indicaciones para obtener espermatozoides testiculares son: azoospermia no obstructiva (bloqueo madurativo, hipoespermatogénesis severa, síndrome de sólo célula de Sertoli incompleto), azoospermia obstructiva (bloqueo de la rete testis, ausencia de espermatozoides en el epidídimo, agenesia del epidídimo, cicatrización extensa), aneyaculación (que no responde a la electroeyaculación o vibroestimulación), necroteratozoospermia total, e inmovilidad espermática total. Más recientemente se ha sugerido que en casos de fallo repetido de embarazo en más de 2 ciclos de ICSI, con niveles de fragmentación de DNA > 15% por TUNEL, se podría realizar TESA o TESE en ciclos posteriores (Greco et al.,2005). Es importante puntualizar que aún en casos en los que exista patrón de sólo célula de Sertoli en la mayoría de los túbulos seminíferos, algunos túbulos podrían estar produciendo espermatozoides. A pesar de que en estos casos existe azoospermia los testículos suelen ser de tamaño reducido y los niveles de FSH elevados, existe un 30 a un 40% de probabilidad de que TESA o TESE nos permita conseguir espermatozoides. En casos de microdelecciones Yq11 tipo AZFa o AZFb, o en casos de bloqueo madurativo total, es inútil realizar TESE o TESA, ya que no se van a encontrar espermatozoides en el testículo (Hopps et al., 2003).

La técnica de TESA es una técnica cerrada que consiste en realizar una aspiración con una aguja transcutánea insertándola directamente en el parénquima testicular y haciendo presión negativa para poder aspirar. Se suelen realizar de 2 a 10 pases a través del tejido testicular. En el caso de TESE se hace una incisión transversal de 1cm a través de la túnica vaginal hasta llegar a la túnica albugínea, tratando siempre de obtener tejido de la parte anterior del testículo lo más alejado posible de la rete testis. Se exponen varios túbulos seminíferos que se cortan con unas tijeras microquirúrgicas y se transfieren a una placa de Petri que contiene 1 ml de medio de cultivo. Una biopsia suele ser suficiente. Sin embargo, en casos de síndrome de sólo células de Sertoli incompleto podría ser necesario realizar de 3 a 6 biopsias. Otra modalidad más reciente es el uso del microscopio durante la biopsia para identificar los túbulos seminíferos de mayor diámetro con mayor probabilidad de contener espermatozoides, y evitar además el puncionar vasos sanguíneos (Ostad et al., 1998). Una vez que las biopsias se han llevado al laboratorio, el tejido testicular se corta finamente mediante microtijeras, se pasa a un tubo Falcon y se centrifuga a 400g durante 5 minutos. El pellet resultante se diluye en 0,3 ml de medio de cultivo y se examina al microscopio para ver si hay espermatozoides testiculares. Inicialmente, la motilidad es muy baja o nula y hay que esperar unas horas (de 5 a 10 horas) pa­ra que la motilidad sea máxima. Otros autores han reportado que se puede encontrar motilidad hasta 3 días después de iniciar la incubación del tejido testicular. Este suele ser lo que ocurre en casos de azoospermias obstructivas pero no en caso de azoospermias no obstructivas. Otros autores recomiendan el uso de pentoxifilina para mejorar la motilidad; sin embargo, esto requeriría el uso de centrifugación para eliminarla antes de hacer ICSI. Cuando existe una alta contaminación de glóbulos rojos también se puede recurrir al tratamiento con el medio de lisis de eritrocitos (Sigma R-1129);sin embargo,este reactivo podría afectar la motilidad espermática, ya que es un medio hipotónico y, por lo tanto, podría dañar la membrana de los espermatozoides.

Congelación y descongelación de espermatozoides del epidídimo

Dado que la recuperación de espermatozoides móviles del epidídimo post­descongelación es mejor cuando la muestra es procesada antes de su congelación, se recomienda el uso de gradientes de densidad. Una vez que se haya conseguido un número suficiente de espermatozoides para ICSI, el resto de la muestra se combina y se procesa para su congelación. Las muestras procesadas se concentran en un volumen de 0,5 a 1,0 ml y se diluye 1:1, v/v, con medio de congelación (TEST-yolk buffer con glicerol, lrvine Scientific, Santa Ana, CA). El medio TEST-yolk buffer con glicerol proporciona el medio más eficaz para la recuperación de espermatozoides móviles después de la congelación. Algunos consejos prácticos son: (i) el medio de congelación debe añadirse lentamente gota a gota durante un período de al menos 5 minutos, mezclando continuamente según se va añadiendo el crioprotector; (ii) incluso si la concentración de espermatozoides epididimarias es baja, cada muestra debe dividirse en varios criotubos (una media de 3 por paciente). Esto va a facilitar que se puedan llevar a cabo más ciclos de ICSI en el futuro sin tener que volver a aspirarlos del epidídimo; (iii) la tasa de congelación ideal para espermatozoides del epidídimo se alcanza cuando los criotubos se exponen a vapores de nitrógeno líquido a -70°C durante la noche a unos 5 cm por encima del menisco. Al día siguiente se sumergen en nitrógeno liquido (-196ºC). Hay varios métodos alternativos de congelación. La diferencia principal entre estos métodos está en la tasa de congelación y no en los medios de congelación. Por ejemplo, uno de estos métodos consiste en mantener el criotubo a -20″C durante 30 minutos, seguido de la exposición a vapores de nitrógeno líquido durante 10 minutos e inmersión posterior en nitrógeno líquido.

Para la descongelación, se incuba el criotubo a 37°C durante 5 minutos, luego se diluye de 5 a 10 veces en medio de cultivo y se procesa a través de un gradiente de densidad. El pellet se resuspende en un volumen pequeño de medio de cultivo y se seleccionan los espermatozoides móviles para ICSI. En caso de que solo se disponga de un criotubo, es posible evitar la descongelación de todo el espécimen haciendo el llamado scraping off que consiste en descongelar la parte superior del criotubo y transferir una alícuota a una placa de Petri.

Congelación y descongelación de espermatozoides testiculares

En la gran mayoría de los casos, los espermatozoides testiculares se obtienen a partir de la técnica de TESE, si bien en algunos centros también se obtiene a partir de la técnica de TESA. A la suspensión de espermatozoides testiculares disueltos en 0,3 ml de medio de cultivo se le añade gota a gota y lentamente 0,3 ml de TEST-yolk buffer con glicerol (dilución 1:1, v/v). Esto se realiza durante unos 5 minutos con agitación continua según se van añadiendo las gotas del medio crioprotector. Esto facilita que se produzca un equilibrio osmótico eficiente sin que se altere la osmolaridad celular de forma brusca. Los criotubos se congelan de forma similar a como habíamos descrito en el caso de espermatozoides del epidídimo. Otros autores utilizan pajuelas de 0,5 ml que se incuban primero a temperatura ambiente durante 10 minutos seguido de a 4°C durante otros 10 minutos y 10 minutos en los vapores antes de ser sumergidas en nitrógeno líquido (Al-Hasaní et al.,1999). Otros grupos utilizan congelación programada con el Planer Kryo10 III (Messer Griesheim, Germany), donde se hace una congelación inicial a -30°C durante los primeros 5 minutos y luego se congelan exponencialmente a -150°C en los 55 minutos siguientes.

Cuando el número de espermatozoides testiculares es extremadamente bajo, se puede recurrir a la técnica de single sperm freezing donde unos cuantos espermatozoides (hasta 5) y el crioprotector (8% glicerol en PBS suplementado con 3% HSA) son microinyectados en zonas pelúcidas vacías (Cohen et al.,1997). Las zonas pelúcidas con los espermatozoides se cargan en pajuelas de 0,25 ml, se exponen a vapores de nitrógeno líquido durante la noche y se sumergen en nitrógeno líquido al día siguiente.

Para la descongelación, por la mañana temprano el día de la punción folicular, el criotubo se descongela a temperatura ambiente durante 10 minutos y el contenido se transfiere a un tubo Falcon y se añaden gota a gota y muy lentamente 5 ml de medio de cultivo. Después de mezclar bien la suspensión, se centrifuga a 300g durante 5 minutos y el pellet se resuspende en 100μl de medio de cultivo. Unos pocos μl de esta suspensión se van a utilizar para ICSI. Esta suspensión se debe incubar a temperatura ambiente durante un mínimo de 4 horas para poder maximizar la motilidad de los espermatozoides testiculares.

Cuando se congela tejido testicular en lugar de suspensiones de espermatozoides testiculares, la muestra de tejido se descongela incubándola en un baño de agua a 37ºC durante 3 minutos, se centrifuga dos veces con medio de cultivo (p.e., Ham’s F10)  y luego el pellet de tejido testicular se corta finamente con  microtijeras (Al-Hasaní  et al., 1999). El sobrenadante se incuba durante 5 horas en un incubador de C0₂ a 37°C y después se centrifuga  a 500g durante 1 minuto. El pellet se resuspende  con 3μl de medio Ham’s F10 del cual se pueden obtener espermatozoides con movimiento flagelar. Los espermatozoides de tejido testicular congelado también se pueden extraer utilizando métodos enzimáticos como el uso de colagenasa (Kupker et al., 2000).

Purificación microbiológica y vírica del semen

Un estudio reciente ha reportado que los gradientes de sílica coloidal, cuando se usan en combinación con técnicas asépticas, pueden abolir casi totalmente la contaminación bacteriana durante la preparación del semen para TRA (Nicholson et al., 2000). Otros estudios indican que el uso de gradientes de densidad reduce la carga viral de VIH en el pellet del gradiente (Politch et al.,1999; 2004).

El protocolo que actualmente se recomienda en la preparación del semen de pacientes seropositívos para VHC y VIH para TRA incluye dos pasos de di­lución y centrifugación, un gradiente de densidad y un swim-up (Politch et al.,2004; Garrido et al., 2001). Antes de describir en detalle el protocolo, es importante puntualizar que la preparación del semen de pacientes seropositivos para VHC y VIH debe realizarse en una cabina de seguridad biológica (Clase 11/83), que es el nivel de seguridad recomendado en estos casos (Kruse et al.,1991). Además, deberían utilizarse centrífugas e incubadores exclusivamente dedicados para este fin.

Básicamente, una vez que se han evaluado los parámetros seminales en el semen licuado, se hace un lavado del semen haciendo una dilución 1:1, v/v,con medio de cultivo, seguido de centrifugación a 400g durante 10 minutos. Se elimina el sobrenadante y el pellet se resuspende en 1 ml de medio de cultivo. A continuación, se prepara un gradiente de tres capas (50/70/90%) utilizando cualquiera de los gradientes habituales, se carga la muestra y se centrifuga a 300g durante 20 minutos. Una vez finalizada la centrifugación, se recoge el pellet, se diluye de nuevo con medio de cultivo, se centrifuga a 300g por 10 minutos, se elimina el sobrenadante y se añaden lentamente sobre de la pared del tubo 0,5 ml de medio de cultivo y se hace un swim-up durante 60 minutos a 37ºC. Finalmente, se aspiran unos 350μl de la capa superior con especial cuidado, y se analizan los parámetros de concentración y motilidad. Si se va a hacer análisis de carga viral por RT-PCR, una alícuota de la muestra se almacena en nitrógeno líquido para su análisis y el resto se trata con crioprotectores para su congelación y posterior uso, en caso de que la carga viral esté por debajo de los límites recomendados (Garrido et al., 2001).