INTRODUCCIÓN

Con los recientes avances en los protocolos de crioconservación, la crioconservación de blastocistos se ha convertido en una herramienta fácil y fiable para preservar aquellos embriones que han expresado su máximo potencial de desarrollo in vitro (Menezo, 2004). A pesar de que la congelación lenta continua siendo la técnica más utilizada para la crioconservación de los embriones bovinos producidos in vivo o in vitro, la vitrificación ha surgido en la última década como una alternativa prometedora y es, en la actualidad, el método de elección debido a que es un procedimiento rápido que no requiere de equipo especial y proporciona buenos resultados en diferentes especies (Berthelot et al., 2000; Vajta et al., 1998) y especialmente cuando se trabaja con ovocitos o embriones producidos in vitro o micromanipulados (Pereira et al., 2008). La vitrificación utiliza soluciones de agentes crioprotectores (CPAs) con concentraciones muy elevadas, que provocan un incremento de la viscosidad de las soluciones provocando la formación de un estado sólido amorfo semejante al vidrio. Debido al uso de estas elevadas concentraciones de CPAs, el contacto de las células con los CPAs y las tasas de enfriamiento deben ser lo suficientemente rápidas para evitar los efectos tóxicos y la formación de cristales intracelulares que puedan dañar al embrión.

Hasta la actualidad, se han descrito diferentes dispositivos como soportes para la vitrificación de embriones preimplantacionales y su posterior almacenaje. entre ellos, citar las rejillas de microscopia electrónica (EM grids), las open pulled straws (OPs) y los sistemas cryoloop, cryotop, cryoleaf, cryotip, nylon mesh y metal mesh, entre otros. Estos dispositivos se desarrollaron con el objetivo de maximizar la velocidad de enfriamiento utilizando volúmenes de solución muy pequeños, proporcionando resultados desiguales de supervivencia y desarrollo embrionario tras su utilización (revisado por Vajta and Kuwayama, 2006). La criotolerancia de los embriones obtenidos in vitro es mucho menor a la de los embriones obtenidos in vivo (Rizos et al., 2002). Se cree que esta diferencia puede depender bien de las condiciones de cultivo, especialmente cuando el medio de cultivo contiene suero que provoca una excesiva acumulación de lípidos durante el desarrollo embrionario (Rizos et al., 2003), o bien del estadio de desarrollo en el que son conservados. La crioconservación de embriones en fase de blastocisto es todavía un reto debido a sus características inherentes, tales como: 1) la penetración lenta de los CPAs en el blastocisto, en gran parte debido a su naturaleza multicelular, 2) la zona pelúcida (ZP), que actúa como una barrera fisiológica a la penetración de los CPAs, y 3) la presencia del blastocele. Diferentes autores realizaron la vitrificación de embriones bovinos en estadio de blastocisto expandido debido a que en este estadio la ZP es más delgada y permite mejor la penetración de los CPAs que en el estadio de blastocisto temprano (Rios et al., 2010; Sommerfeld y Niemann, 1999) mientras que otros autores abogan por la vitrificación de embriones en estadio de blastocisto temprano, pues consideran que el incremento de tamaño del blastocele de los blastocistos expandidos favorece la formación de cristales de hielo y, por tanto, de lesiones celulares durante la vitrificación (Cho et al., 2002; Vanderzwalmen et al., 2002). Por otra parte, diferentes estudios, como los de Hiraoka y colaboradores (2007) o Zech y colaboradores (2005) en embriones humanos, observaron que la rotura de la ZP mejoraba los porcentajes de gestación después de vitrificar embriones eclosionados, ya que, y según apuntan estos autores, la rotura de la ZP favorece la exposición del blastocele a los CPAs y facilita tanto la deshidratación como la posterior hidratación de éste.

La apoptosis es una respuesta celular a las condiciones subóptimas y a los diferentes tipos de estrés que un embrión puede sufrir durante el proceso de crioconservación. La viabilidad de los embriones y su potencial de desarrollo se han relacionado con la proporción entre el número de blastómeros con el DNA dañado (TUNEL positivo) y el número total de blastómeros, conocido como el índice de apoptosis, observándose un mayor índice de apoptosis en embriones de menor calidad. La evaluación de la fragmentación del DNA mediante [TdT]- dUTP nick (TUNEL) ha sido utilizada como un método fiable para la detección de la apoptosis en los embriones. Hasta la actualidad, existen pocos informes sobre los cambios producidos en los índices de apoptosis de los blastocistos bovinos en respuesta a los procesos de vitrificación/calentamiento (Behr et al., 2002; Pomar et al., 2005).

En estudios previos realizados por Morató y colaboradores (2008), se puso a punto con éxito el uso del cryotop como soporte para la vitrificación de ovocitos bovinos madurados in vitro, siendo éste el soporte que se utiliza de forma rutinaria en nuestro laboratorio. en el estudio que nos ocupa, se evaluó la capacidad de blastocistos bovinos producidos in vitro para sobrevivir a un proceso de vitrificación/calentamiento. Para ello, se vitrificaron los blastocistos en diferentes fases de desarrollo embrionario obtenidos tras 7 u 8 días de cultivo in vitro. Nuestro trabajo también fue diseñado para determinar los efectos que la fase de desarrollo o la duración del cultivo in vitro podían provocar sobre las tasas de fragmentación del DNA de embriones sometidos a un proceso de vitrificación /calentamiento.

MATERIALES Y MÉTODOS

A menos que se indique lo contrario, todos los productos químicos y los reactivos fueron adquiridos en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).

Obtención de los ovocitos y maduración in vitro

Para la producción in vitro de embriones, se ha seguido el protocolo descrito previamente por Rizos y colaboradores (2001). Para la obtención de ovocitos, se obtuvieron ovarios de hembras sacrificadas en un matadero local cercano a la Facultad de Veterinaria (UAB) y se transportaron al laboratorio en una solución salina tamponada (Phosphate Buffered Medium; PBS) a 35-37 ºC. Los complejos cúmulo-ovocito (COCs) se obtuvieron mediante aspiración de aquellos folículos que presentaban un diámetro comprendido entre 2 y 10 mm. después de tres lavados en PBS modificado (PBS suplementado con 36 mg/ml de piruvato sódico, 50 mg/ml de gentamicina y 0,5 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA)), grupos de hasta 50 COCs se colocaron en 500 μl de medio de maduración en placas de cuatro pocillos y se cultivaron durante 24 horas a 38,5 ºC, en una atmósfera con un 5% de CO₂ en aire y máxima humedad. El medio de maduración estaba compuesto por medio TCM199 suplementado con un 10% (v/v) de suero fetal bovino (Fetal Calf Serum, FCS), 10 ng/ml de epidermal growth factor y 50 mg/ml de gentamicina.

Fecundación in vitro

Para la fecundación in vitro, los COCs se lavaron cuatro veces en PBS y después en el medio de fecundación, antes de ser colocados, en grupos de hasta 50, en placas de cuatro pocillos que contenían 250 μl de medio de fecundación (medio Tyrode’s suplementado con 25mM de bicarbonato sódico, 22mM lactato sódico, 1mM piruvato sódico, 6 mg/ml Bsa y 10 mg/ml heparina (Calbiochem, Darmstadt, Alemania)). Los espermatozoides móviles fueron obtenidos mediante la centrifugación de semen de toro congelado/descongelado (ASEAVA, Llanera, Asturias, España) a través de un gradiente discontinuo de Percoll (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (2,5 ml de Percoll al 45% (v / v) y 2,5 ml de Percoll al 90 % (v / v)) durante 8 minutos a 700g y a temperatura ambiente (22-25 ºC). El pellet obtenido del fondo de la fracción 90%, se lavó en medio Tyrode’s tamponado con Hepes y se centrifugó a 100 g durante 5 min. La concentración de los espermatozoides se evaluó en un hematocitómetro y se diluyeron en un volumen apropiado de medio de fecundación para conseguir una concentración final de 2×10⁶ espermatozoides/ml. Una alícuota de 250μl de esta suspensión se añadió a cada uno de los pocillos de fecundación para obtener una concentración final de 1×10⁶ espermatozoides/ml. Las placas se incubaron a 38,5 ºC en una atmósfera con un 5% de CO₂ en aire y máxima humedad. La variación individual entre toros se redujo mezclando muestras de semen de los mismos dos toros en todos los experimentos.

Después de la incubación con los espermatozoides durante 22 h, los presuntos cigotos fueron transferidos a gotas de 25μl de medio de cultivo de fluido oviductal sintético (Syntetic Oviductal Fluid; SOF) (1 embrión / μlitro) durante 7 u 8 días a 38,5 ºC, en un ambiente con un 5% CO₂ y un 5% de O₂ y máxima humedad. Las tasas de división se registraron a las 48 horas post-inseminación y el número de blastocistos obtenidos se evaluó a los 7 y 8 días después de la inseminación.

Clasificación de los blastocistos

Después de asegurar la calidad de los embriones (Gomez et al., 2008), los blastocistos fueron clasificados de acuerdo al grado de expansión del blastocele en 3 grupos, cada uno de la siguiente manera: 1) blastocistos no expandidos: el volumen del blastocele es menor al de la mitad del volumen total del blastocisto; 2) blastocistos expandidos: el volumen del blastocele es más de la mitad del volumen total del blastocisto, y 3) blastocistos eclosionando o eclosionados: blastocistos con la ZP abierta o sin ZP.

Vitrificación y calentamiento de los blastocistos

Los blastocistos fueron vitrificados utilizando el cryotop como soporte de vitrificación. El cryotop consiste en una película de polipropileno estrecha y delgada (0,4 mm de ancho, 20 mm de largo y 0,1 mm de grosor) unido a un mango de plástico duro. Para proteger el dispositivo de daños mecánicos durante el almacenamiento, se coloca un tubo de plástico para cubrirlo (Kitazato Supply Co., Fujinomiya, Japón). el medio de mantenimiento (MM) utilizado para formular la solución de vitrificación y de calentamiento consistía en medio TCM 199-Hepes con un 20% de FCS. Los blastocistos fueron transferidos a la solución de equilibrio (ES) compuesta por un 7,5% de etilenglicol (EG) y un 7,5% de dimetilsulfóxido (DMSO) en MM durante 10 – 15 min. A continuación, los blastocistos fueron trasladados a la solución de vitrificación (VS) compuesta por un 15% de EG, 15% DMSO y 0,5 M de sacarosa disuelta en MM. Después de una incubación de 30-40 s, los blastocistos (hasta un máximo de 2) se cargaron en el cryotop, se eliminó casi toda la solución sobrante hasta dejar solamente una capa delgada de medio que cubría el/los blastocisto/s y la muestra fue rápidamente sumergida en nitrógeno líquido. Posteriormente, se colocó la tapa de plástico. El proceso desde la inmersión en VS hasta el nitrógeno líquido se completó en menos de un minuto.

Durante el proceso de calentamiento, se retiró el protector de plástico del cryotop cuando todavía estaba sumergido en nitrógeno líquido. A continuación, el cryotop se sumergió directamente en la solución de calentamiento compuesta por 1 M sacarosa disuelta en MM. Después de 1 min, los blastocistos se colocaron en la solución de dilución, que contenía 0,5 M de sacarosa disuelta en MM. Los blastocistos fueron incubados durante 3 min realizando un suave pipeteo para facilitar la difusión de los CPAs fuera del embrión. Posteriormente, los blastocistos fueron incubados en MM durante 5 minutos. Y, finalmente, se pasaron de nuevo a MM durante 1 minuto antes de su transferencia al medio de cultivo SOF a 38,5 °C, en una atmósfera con un 5% CO₂ y un 5% de O₂ y máxima humedad. La supervivencia de los blastocistos se evaluó como la capacidad de re-expansión de los blastocistos después de 3 horas de incubación en medio SOF.

Valoración de la fragmentación del DNA de los embriones

Tras 3 horas de incubación en SOF, y una vez evaluada su supervivencia, los embriones fueron fijados en paraformaldehído al 4% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la fijación, se lavaron por lo menos tres veces en pBs con 0,3% de polivinilpirrolidona (PVP) y se permeabilizaron en 0,5% Triton X-100 durante 2 min. Los embriones fueron lavados tres veces en PBS / PVP y se incubaron en el cóctel de TUNEL (in-situ Cell death detection kit; Roche Diagnostic Inc., Indianapolis, IN) a 37 ºC durante 1 h en oscuridad. Se incluyeron muestras control positivas y negativas en cada ensayo. Los blastocistos expuestos a DNasa I durante 15 min a temperatura ambiente se utilizaron como controles positivos y los blastocistos no expuestos a la enzima TdT terminal fueron los controles negativos. Los embriones fueron lavados en PBS y finalmente se transfirieron a la solución de Hoechst 33342 (25 mg/ml) durante 30 min a 37 ºC en oscuridad. Por último, los blastocistos fueron montados en portaobjetos tratados previamente con poli-L-lisina, se cubrieron con una gota de medio de montaje y un cubreobjetos y los bordes se sellaron con esmalte de uñas. Las muestras se almacenaron a -20 ºC en oscuridad hasta su análisis en el microscopio confocal. Las imágenes se capturaron con un microscopio Leica TCS-SP2 láser confocal de barrido (Leica Microsystems, Heidelberg). Las longitudes de onda de excitación de la pieza fueron 364 nm para la tinción de Hoechst y 488 nm para el FITC-TUNEL conjugado. Los núcleos fueron anotados ya sea como intactos (TUNEL (-), marca roja) o DNA fragmentados (TUNEL (+), marca verde) y contados. El índice apoptótico se calculó como la proporción de TUNEL (+) / número total de núcleos, y el índice de integridad del DNA se calculó como TUNEL (-) / número total de núcleos.

Análisis estadístico

Los datos fueron analizados utilizando el paquete de análisis estadístico systems (SAS, V8). Se obtuvieron al menos 10 réplicas de los datos. Los recuentos de células de los blastocistos en los diferentes grupos experimentales fueron analizados mediante ANOVA (PROC GLM). Las comparaciones de las tasas de supervivencia de los blastocistos después del proceso de vitrificación/calentamiento entre los distintos grupos de blastocistos se llevaron a cabo mediante el test de chi cuadrado. Los datos de supervivencia se transformaron en porcentajes de frecuencia, mientras que el recuento de células de los blastocistos fue expresado como valor absoluto. El nivel de significación estadística se fijó en p <0,05.

RESULTADOS

Experimento 1: porcentajes de supervivencia después de la vitrificación de los blastocistos según su estadio de desarrollo o permanencia en cultivo in vitro.

La tabla I muestra los resultados correspondientes a los porcentajes de supervivencia post-calentamiento de los blastocistos bovinos tras ser vitrificados en diferentes estadios de desarrollo o tras diferente duración del cultivo embrionario in vitro. Así, se observó un aumento significativo de la tasa de supervivencia cuando los blastocistos fueron vitrificados en estadio de blastocisto expandido (79,1% y 53,5%) o eclosionado (73,7% y 54,4%) en comparación con los blastocistos no expandidos (52,1% y 30,8%) (días 7 y 8 post-inseminación, respectivamente). No se observaron diferencias significativas en los porcentajes de supervivencia entre los blastocistos vitrificados en el estadio embrionario expandido o eclosionado. Cuando se analizó el efecto del tiempo de cultivo embrionario in vitro, las tasas de supervivencia fueron significativamente más altas en aquellos blastocistos obtenidos y vitrificados en día 7 del cultivo embrionario (52,1%, 79,1% y 73,7%) comparado con los blastocistos obtenidos en día 8 (30,8%, 53,5% y 54,4%).

Experimento 2: Índice de integridad del DNA de las células de los blastocistos vitrificados según su estadio de desarrollo o permanencia en cultivo in vitro.

El daño celular en blastocistos bovinos vitrificados se evaluó a las 3 horas postcalentamiento mediante la tinción de TUNEL. Se compararon las tasas de integridad del DNA entre los blastocistos del grupo control (no vitrificados) y los blastocistos vitrificados en estadio de blastocisto no expandido, expandido o eclosionado (tabla II).

Los resultados muestran una ligera disminución en el índice de integridad del DNA en respuesta al proceso de vitrificación/calentamiento en comparación con el grupo de embriones no vitrificados (control), disminución que no fue significativa. No se observaron diferencias significativas entre los distintos estadios de desarrollo de los blastocistos, ni entre la duración del cultivo in vitro. La figura 1 muestra imágenes de microscopía confocal donde se observan blastocistos teñidos con la tinción de TUNEL.

DISCUSIÓN

La crioconservación de los embriones bovinos producidos in vitro (PIV) es un requisito previo para su uso a gran escala comercial. Las tasas de gestación obtenidas después de la transferencia de embriones bovinos PIV congelados son relativamente bajas, lo que supone un claro indicio de su menor calidad en comparación con aquellos embriones obtenidos in vivo. La crioconservación de embriones en la etapa de blastocisto permite una mejor selección de los embriones y sirve para aumentar al máximo el potencial de implantación de la posterior transferencia del embrión. El grado de desarrollo del blastocisto en el momento de la vitrificación puede ser un factor clave que influya en los resultados. En este estudio, se observó un aumento significativo de la tasa de supervivencia de aquellos blastocistos vitrificados en estadio de blastocisto expandido o eclosionado. Además, se observaron tasas similares en la integridad del DNA entre los blastocistos vitrificados y aquellos blastocistos frescos (no vitrificados). Entre los numerosos factores que afectan la supervivencia a la crioconservación, distintos estudios han descrito que tanto la edad, la etapa de desarrollo, la calidad del embrión o las interacciones entre estos factores son muy importantes durante la crioconservación de embriones bovinos PIV (Carvalho et al., 1996; Mahmoudzadeh et al., 1995; Pugh et al., 1998; Saha et al., 1996).

Varios estudios han descrito diferencias en las tasas de supervivencia o porcentajes de eclosión después de la crioconservación de blastocistos obtenidos tras diferentes tiempos de cultivo in vitro, haciendo hincapié en que la duración del cultivo de embriones afecta a la criotolerancia de los blastocistos producidos (Cseh et al., 1996; Gustafsson et al., 2001; Hasler et al., 1995; Hasler et al., 1997; Havlicek et al., 2009). Gustafsson y colaboradores (2001) observaron que los embriones obtenidos después de 7 días de cultivo in vitro mostraban 3 veces más posibilidades de sobrevivir a la congelación y descongelación que aquellos embriones congelados en los días 8-9 de cultivo embrionario in vitro, independientemente de su fase de desarrollo. En un estudio más reciente, Havlicek y col. (2009) describieron resultados similares en embriones bovinos crioconservados mediante técnicas de congelación lenta. Observaciones similares se obtuvieron cuando la vitrificación fue utilizada como método de crioconservación de embriones bovinos (Mahmoudzadeh et al., 1995; Ohboshi et al., 1997; Saha and Suzuki, 1997). Nuestros resultados están de acuerdo con estas observaciones, ya que las tasas de supervivencia significativamente más altas se registraron en aquellos blastocistos obtenidos y vitrificados en día 7 de cultivo in vitro. En contraste, Dinnyés y colaboradores (1999) observaron que la supervivencia de los blastocistos vitrificados en día 7 o en día 8 era similar.

En nuestros experimentos, la supervivencia está relacionada con una fase embrionaria más avanzada en un día determinado. Las razones de las altas tasas de supervivencia de los embriones en sus etapas más avanzadas aún quedan por aclarar. En nuestro estudio se observó que cuando el volumen del blastocele era mayor, la deshidratación de éste era más pronunciada y constante. Estos blastocistos presentaban una ZP más delgada y posiblemente más permeable que la de aquellos blastocistos en fases tempranas (no expandidos). En contraste con nuestros resultados, algunos estudios han descrito que los blastocistos expandidos muestran tasas de supervivencia inferiores después de los procesos de vitrificación en comparación con los blastocistos no expandidos (Cho et al., 2002; Vanderzwalmen et al., 2002). En este tipo de blastocistos, que presenta un blastocele mayor que el de los no expandidos, se pueden formar cristales de hielo durante la congelación, provocando daños mecánicos. Considerando este factor, se ha postulado que la reducción artificial del contenido líquido del blastocele podría mejorar la eficiencia de la vitrificación (Hiraoka et al., 2004a; Son et al., 2003; Vanderzwalmen et al., 2002). Sin embargo, los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que la vitrificación de los blastocistos expandidos mejoró los resultados del calentamiento sin la necesidad de la aspiración del blastocele.

Son pocos los trabajos relacionados con la vitrificación de blastocistos en estadio de eclosión o completamente eclosionados (Galan et al., 2003; Hiraoka et al., 2004b; Zech et al., 2005). Las técnicas de reproducción asistida deben considerar la posibilidad de crioconservar blastocistos con una ZP abierta o completamente eclosionados como un reto importante, especialmente cuando se trata de embriones procedentes de cultivos embrionarios prolongados o sometidos a un diagnóstico genético preimplantacional. Los buenos resultados de supervivencia a la descongelación obtenidos en este estudio tras la vitrificación de embriones eclosionados demuestran que la presencia de una ZP intacta no es necesaria para que la vitrificación tenga éxito, y son similares a los obtenidos en estudios donde se realizó una biopsia embrionaria previa al proceso de congelación lenta (Gustafsson et al., 1994; Schmidt et al., 1992) o de vitrificación (Agca et al., 1995).

Una vez evaluada la supervivencia de los blastocistos bovinos, procedimos a evaluar su integridad mediante la determinación del índice de apoptosis. El índice de apoptosis de un blastocisto es un factor importante que ha sido correlacionado negativamente con el potencial de desarrollo embrionario (Makarevich and Markkula, 2002; Spanos et al., 2002). Después de la crioconservación, los blastocistos bovinos inician una reorganización celular, particularmente a nivel del citoesqueleto, el cual puede estar parcialmente despolimerizado debido a la presencia de los CPAs o al proceso de crioconservación (Dobrinsky, 1996). Por otra parte, las membranas celulares también pueden sufrir diferentes lesiones durante el proceso de crioconservación (Acker and Mcgann, 2001; Wolfe and Bryant, 1999), cuya magnitud puede influenciar la supervivencia embrionaria. A pesar de que nuestros resultados no muestran diferencias en los niveles de apoptosis entre embriones frescos y vitrificados, se debe tener en cuenta que se analizó la fragmentación del DNA 3 horas después del calentamiento, lo que nos lleva a hipotetizar que o bien el daño provocado por el proceso de vitrificación a nivel de DNA fue transicional y que las células pudieron restablecer su integridad durante el periodo post-calentamiento, o que dicho periodo no fue suficiente para cuantificar la cantidad de daño producido por el proceso de vitrificación/calentamiento. Utilizando diferentes criosoportes, Park y colaboradores (2006) sí observaron un índice apoptótico significativamente superior cuando se vitrificaron blastocistos bovinos PIV en día 7 en pajuelas de 0,25ml (11,9%) o en pajuelas minimum volume cooling (MVC) (11,0%), comparado con los embriones no vitrificados (3,0%).

En conclusión, el tiempo de cultivo embrionario in vitro para obtener los blastocistos, así como el estadio de desarrollo de éstos, son factores importantes a considerar durante el proceso de vitrificación de embriones bovinos producidos in vitro. Más específicamente, nuestros resultados indican que la vitrificación utilizando el cryotop como soporte parece ser particularmente útil para la criopreservación de blastocistos bovinos con un alto grado de expansión (blastocistos expandidos o eclosionados), y, principalmente, en aquellos blastocistos vitrificados en día 7 post- inseminación.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio ha sido financiado por Ministerio Español de Educación y Ciencia (número de proyecto: AGL2007-60227/GAN) y de la Universidad Autónoma de Barcelona (número de la donación: EME2004-25).