INTRODUCCIÓN

La Inseminación Artificial Conyugal (IAC) es la primera opción terapéutica en aquellas parejas infértiles que presentan, al menos, integridad anatómica de las trompas de Falopio, y un número de espermatozoides con movilidad progresiva tras la capacitación (REM) superior a 5×10⁶ Millones (WHO, 1999).

Se sabe que la integridad del ADN paterno es necesaria para la consecución de un embarazo a término (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000; Fernández et al., 2003), y que existe una correlación negativa entre dicha integridad y la fertilidad tanto in vivo como in vitro (Evenson et al., 1999; Saleh et al., 2002). Además, existe cierta controversia en cuanto a si hay alguna relación entre el porcentaje de fragmentación del ADN espermático y los parámetros seminales analizados rutinariamente como concentración y movilidad (Irvine et al., 2000; Cohen-Bacrie et al., 2009). Esta integridad del ADN espermático se puede estimar, entre otras técnicas, mediante el test SCD (Sperm Chromatin Dispersion), que consiste en producir una descondensación diferencial de la cromatina entre aquellos espermatozoides que presentan ADN fragmentado con respecto a aquellos que lo mantienen intacto.

Evenson et al. (2002), mediante la técnica SCSA, consideraron que valores del índice de fragmentación de ADN espermático entre 25-30% corresponden a un bajo potencial para la fecundación, y valores superiores al 30% corresponden a un potencial muy bajo (cercano a cero). Sergerie et al. (2005) propone un valor umbral del 20% con el ensayo TUNEL, y Fernández et al. (2005) de un 27% usando SCD. Bungum et al. (2007), publicó que las parejas que realizan IAC tienen una mayor tasa de embarazo cuando el porcentaje de fragmentación es inferior del 30% con la técnica SCSA.

El estudio de semen para Técnicas de Reproducción Asistida (TRA) que se realiza en la Fundación Jiménez Díaz incluye el análisis del volumen, la concentración, la movilidad y el REM. Éste nos permite evaluar si una muestra de semen es adecuada para realizar una IAC. El valor de REM mínimo recomendado por la OMS 1999 para indicar inseminación conyugal es de 5 millones de espermatozoides móviles. Debido a que en nuestro centro no se tiene en cuenta la integridad del ADN espermático para recomendar IAC como TRA, nos proponemos, como objetivo de este trabajo, valorar la utilidad de la inclusión del test de fragmentación de ADN en el estudio inicial del semen.

MATERIALES Y MÉTODOS

En este estudio, realizado en el laboratorio de Andrología de la Fundación Jiménez Díaz en el periodo comprendido entre abril y junio de 2010, fueron analizadas un total de 50 muestras seminales.

Criterios de inclusión: Varones cuya edad no supere los 45 años, que hayan obtenido la muestra de semen en la Fundación Jiménez Díaz y ésta haya sido completa, con un periodo de abstinencia inferior a 10 días y con un REM mayor de 5 millones. Muestras de semen y procesado: Las muestras fueron recogidas en una sala privada de la Fundación Jiménez Díaz, cercana al laboratorio de andrología, obtenidas por masturbación en frascos de plástico estériles, y procesadas para el estudio de fragmentación en un tiempo no superior a una hora tras la eyaculación.

El análisis inicial de las muestras fue realizado en base a los criterios de la OMS, evaluando volumen, concentración y movilidad de la misma.

La capacitación espermática, necesaria para el cálculo del REM de la muestra, se realizó mediante gradientes de densidad.

La fragmentación del ADN espermático fue estudiada utilizando el Kit Halosperm, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante; los portaobjetos con la muestra fijada fueron teñidos con Diff-Quick.

El contaje de espermatozoides en los portaobjetos teñidos fue realizado siempre por dos observadores, mediante un microscopio de campo claro a 400 aumentos, contando cada uno de ellos un mínimo de 300 espermatozoides, sin existir diferencias significativas entre los resultados obtenidos por ambos observadores. Además, antes del comienzo del estudio, se realizaron 10 contajes de prueba, cuyos resultados fueron contrastados con los obtenidos en un laboratorio con más experiencia en esta técnica, sin que tampoco se observaran diferencias. El análisis estadístico se realizó aplicando el test estadístico no paramétrico de Mann-Whitney.

RESULTADOS

En la Figura 1 se muestran los resultados del estudio, donde se observan los porcentajes de fragmentación de las 50 muestras. Se puede observar que todas las muestras presentan una fragmentación inferior al 20% (valor umbral de fragmentación más bajo en la bibliografía consultada), encontrándose 41 de las 50 muestras analizadas por debajo del 10%.

En la tabla I se muestran los resultados de fragmentación obtenidos relacionados con el REM. Parece existir una relación inversa entre la fragmentación del ADN espermático y el REM, pero, puesto que el tamaño muestral de los grupos es pequeño, no podemos aplicar ningún test estadístico.

Al relacionar el periodo de abstinencia y el porcentaje de fragmentación de la muestra seminal, se observa un incremento de la fragmentación del ADN cuando el periodo de abstinencia es superior a 5 días. Esta diferencia resulta estadísticamente significativa al aplicar el test no paramétrico de Mann- Whitney, con una p = 0,005 (Tabla II).

El tiempo medio hasta el inicio del procesamiento de la muestra de semen para el estudio de la fragmentación del ADN fue de 17 minutos, siendo el tiempo de espera más largo de 45 minutos. Se agruparon los resultados estableciendo como punto de corte 15 minutos. En la tabla III se muestra los resultados, observándose que la media de fragmentación es prácticamente igual.

DISCUSIÓN

En nuestro estudio no se ha encontrado ninguna muestra con un porcentaje de fragmentación por encima de los umbrales de normalidad descritos en la bibliografía consultada (Evenson et al., 2002; Fernández et al., 2005; Sergerie et al., 2005; Bungum et al., 2007). Esto puede ser debido a que todos los eyaculados estudiados tenían un REM superior a 5 millones. Esto implica que, aunque tuvieran algún parámetro seminal alterado, todos tuvieron un recuento total elevado de espermatozoides móviles en el eyaculado. Según Cohen- Bacrie et al. (2009), este tipo de muestras presentan mayoritariamente un grado de fragmentación del 0 al 20%.

En nuestro estudio, al aumentar los días de abstinencia aumenta el porcentaje de fragmentación, lo que concuerda con lo observado por Thomson et al. (2009) y Cohen-Bacrie et al. (2009). El hecho de que el número de pacientes con más de 5 días de abstinencia sea bajo obliga a que esta conclusión sea considerada con reservas, teniendo en cuenta que otros autores como De Jonge et al. (2004) no han observado esta correlación. Según los criterios utilizados en la Fundación Jiménez díaz, las muestras que constituyen nuestra población de estudio serían aptas para IAC. Al incluir los resultados de fragmentación espermática no se modificaría en ningún caso la indicación de IAC, lo que nos hace pensar que la inclusión sistemática del estudio de fragmentación del ADN espermático en este tipo de pacientes no resultaría útil. Sin embargo, debido a que el número de muestras analizado es bajo, sería conveniente aumentar el tamaño muestral para confirmar el resultado.

AGRADECIMIENTOS

Queremos expresar nuestros agradecimientos a URH-García del Real,por su apoyo a la hora de poner en marcha la técnica de la fragmentación del ADN espermático en nuestro laboratorio y su colaboración en los controles de las pruebas de contaje iniciales.