Introducción

 

El uso de las técnicas de reproducción asistida, como tratamiento para infertilidad humana, ha ido incrementándose en los últimos años. La infertilidad humana afecta a un 20% de las parejas en edad reproductiva, siendo la causa principal, en la mitad de los casos, el factor masculino. Además, el 25% de estos casos de infertilidad son de origen idiopático (Evenson et al., 1999).

La fragmentación del ADN espermático es una de las alteraciones que afecta al gameto masculino, estando íntimamente relacionada con defectos genéticos y epigenéticos. En estos últimos años el estudio de la fragmentación de ADN ha ido adquiriendo mayor relevancia en las Unidades de Reproducción Asistida, aunque existe una gran controversia acerca de su valor predictivo.

En el laboratorio de andrología, el estudio del semen que se realiza de manera rutinaria se basa en la guía de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Según los criterios de la misma, el seminograma consta del estudio de una serie de 5 parámetros principales: volumen, pH, movilidad, concentración y morfología; sin embargo,  este tipo de estudios sobre la calidad seminal tiene un poder limitado a la hora de predecir el éxito en el resultado de las TRA, ya que aproximadamente el 15% de los varones infértiles presentan un seminograma normal (Guzik et al., 2001).

Por ello, surge la necesidad de evaluar la integridad del contenido genético del espermatozoide y la posible relación de las alteraciones en la doble cadena de ADN con la infertilidad de origen idiopático masculino (Evenson et al., 1999).

Actualmente, el estudio de la fragmentación seminal está siendo considerado como un nuevo parámetro que puede incorporarse en un estudio básico de semen, a pesar de la controversia que existe en la literatura científica acerca de la influencia del grado de fragmentación espermática y el resultado de la técnica de reproducción realizada (Van der Zwalmen et al., 1991; Janny et al.,  1994)

La importancia de determinar el índice de fragmentación espermático radica en la relación que existe entre este parámetro y la tasa de fecundación, tasa de implantación, calidad embrionaria, e incluso la tasa de aborto (Shamsi et al., 2011). Según el estudio publicado por el grupo de Luke Simon en 2011, se observa una correlación negativa entre el nivel de fragmentación, la tasa de fecundación y la calidad embrionaria obtenida (Simon et al., 2011).

En cuanto a la calidad embrionaria, varios autores encuentran una relación negativa entre el porcentaje de fragmentación espermática y la calidad de los embriones obtenidos (Evenson et al., 1999; Tesarik et al., 2004; Avendaño et al., 2010). Otros estudios han sugerido que este tipo de daño en el material genético se manifiesta durante la etapa de implantación, incluso posteriormente (efecto paterno tardío) (Tesarik et al., 2004). Se ha observado que la presencia de niveles altos de fragmentación en la muestra seminal bloquean el desarrollo de los embriones a estadio de blastocisto (Benchaib et al., 2007; Seli et al., 2004), siendo este bloqueo un proceso comprendido entre la etapa de activación del genoma embrionario y el comienzo de la formación del blastocisto.

También se ha visto una mayor tasa de aborto en aquellos pacientes con un índice de fragmentación (IDF) elevado a los que se les ha realizado ICSI; sin embargo no se han visto estas diferencias cuando la fecundación se realizó mediante FIV convencional (Borini et al., 2006; Benchaib et al., 2007).

Por otro lado, estudios publicados sugieren un cambio de indicación en la TRA a realizar, ya que se ha observado que la tasa de embarazo desciende al realizar IAC cuando el IDF es elevado; sin embargo, no parece verse influenciada al realizar FIV o ICSI (Bungum et al., 2004; Saleh et al,. 2003). Otros trabajos han visto una tasa de embarazo más alta mediante ICSI, en aquellos pacientes cuyo IDF es superior al valor de corte (Bungum et al., 2006).

El objetivo de nuestro estudio fue determinar si existe relación alguna entre los parámetros de un seminograma básico y el índice de fragmentación espermático, así como valorar si el resultado de la fragmentación modificaría la técnica indicada en función del diagnóstico del seminograma previo. También comparamos los resultados obtenidos teniendo en cuenta los criterios OMS 99 con respecto a los criterios OMS 2010.

 

Material y métodos

 

Se trata de un estudio retrospectivo realizado en el Centro Sanitario Virgen del Pilar de San Sebastián desde mayo de 2010, en el que fueron analizados un total de 264 varones.

Las muestras fueron recogidas por masturbación, en botes estériles, con un periodo de abstinencia de entre 2 y 6 días, y con un tiempo de transporte de la muestra inferior a 1 hora.

Aproximadamente 30 minutos más tarde de la recepción de la muestra, y tras observar su licuefacción a temperatura ambiente, se realizó el análisis de los parámetros del seminograma siguiendo los criterios de la OMS 99 procesando posteriormente las muestras mediante la técnica de swim-up.

Las muestras fueron diluidas en proporción 1:1 y posteriormente centrifugadas durante 10 minutos a 400 g; el pellet resultante fue incubado en un volumen final de 400 µl de medio de cultivo. Tras 1 hora de incubación a 37ºC y un 6% de CO₂, se recuperó el sobrenadante, contabilizando el número de espermatozoides móviles mediante cámara Makler, procediendo posteriormente al estudio de la fragmentación.

El REM (Recuento de Espermatozoides Móviles) obtenido nos indicará el tipo de técnica a realizar a la pareja en estudio (desde el punto de vista masculino), siendo los criterios de inclusión para cada técnica: mayor de 5 millones se indica una IAC; entre 3 – 5 millones, FIV convencional; y menor de 3 millones, ICSI.

El análisis de la fragmentación del ADN espermático fue realizado en la muestra capacitada mediante el SCD test (Sperm Chromatin Dispersion), que se basa en la valoración de la presencia/ausencia y tamaño de los halos de dispersión de la cromatina. Para ello se utilizó el kit de Halosperm según protocolo (Fernández et al., 2005).

El porcentaje de fragmentación fue determinado mediante el contaje de 300 espermatozoides por observador a 100X en un microscopio de campo claro bajo aceite de inmersión, siendo cada muestra valorada por dos observadores. El valor umbral utilizado para considerar el porcentaje de fragmentación como alterado fue del 30%.

En aquellos pacientes en los que hubo una alteración en la fragmentación, la TRA realizada fue un ICSI, independientemente del resultado obtenido en el estudio del seminograma.

En cuanto al test estadístico utilizado, los datos fueron analizados mediante el estadístico c², considerando estadísticamente significativo p< 0,05, utilizando el programa SPSS para Windows.

 

 

Resultados

Del total de los varones analizados, la incidencia de fragmentación alterada de ADN espermático fue de un 11% (29/264).

Teniendo en cuenta esta incidencia, los pacientes fueron divididos en dos grupos, siendo los varones con resultado de fragmentación (IDF) menor al 30% nuestro grupo control, y aquellos cuya fragmentación era igual o mayor al 30% nuestro grupo de estudio.

Los resultados obtenidos en cuanto a la relación entre los distintos parámetros del seminograma y la fragmentación de ADN espermático se muestran en la tabla I:

	Astenozoospermia		Teratozoospermia		Oligozoospermia
	OMS 99	OMS 10	OMS 99	OMS 10	OMS 99	OMS 10
IDF <30%	59 (25%)	30 (13%)	235 (100%)	112 (48%)	28 (12%)	21 (9%)
IDF≥30%	25 (86%)	16 (55%)	29 (100%)	18 (64%)	9 (32%)	8 (28%)

 

Tabla I: Prevalencia de los distintos parámetros que se estudian en un seminograma, según los criterios establecidos por la OMS 99 y 2010.

 

Como puede observarse en la tabla I, parece que las principales alteraciones del seminograma podrían estar  relacionadas con el daño en el contenido genético del espermatozoide, aunque no todas en la misma medida; esta posible asociación se muestra más claramente en la gráfica 1.

 

 

Gráfica 1. Relación entre la fragmentación de ADN y los parámetros del seminograma.

 

A la vista de nuestros resultados, siguiendo tanto los criterios de la OMS del 99 como del 2010, el parámetro de astenozoospermia tiene una relación inversamente proporcional con el porcentaje de fragmentación de ADN, siendo este resultado estadísticamente muy significativo (p< 0,001).

Respecto al parámetro de teratozoospermia, la incidencia observada es ligeramente mayor en el grupo de estudio. Nuestros resultados sugieren que hay una cierta tendencia que relaciona  la morfología y el índice de fragmentación, pero los resultados no presentan diferencias significativas, posiblemente debido al pequeño tamaño muestral de uno de los grupos.

En cuanto a la concentración espermática, se observa que existe una relación estadísticamente significativa (p<0,05) entre oligozoospermia y fragmentación de ADN alterada, tanto con los parámetros de la OMS del 99 como con los de 2010.

En la tabla II se muestra el cambio de indicación una vez realizado el estudio de la fragmentación.

	Total	IAC	FIV	ICSI
IDF ≥30%	29	13 (45%)	4 (14%)	12 (41%)
IDF <30%	235	174 (74%)	23 (10%)	38 (16%)

Tabla II. Número de pacientes a los cuales se cambia la indicación.

 

Como puede observarse en la tabla II, un 14% de los pacientes tuvieron una indicación de FIV convencional y en un 45% la técnica de elección fue una IAC, previo al estudio de la fragmentación. Tras el estudio de la misma y basándonos en la literatura publicada, donde la realización de un ICSI en pacientes con un IDF>30% mejora las tasas de embarazo (Bungum et al., 2006), nuestros resultados muestran que un 59% de los varones pertenecientes a nuestro grupo de estudio tuvieron un cambio de indicación de la técnica a realizar. 

Discusión

 

Nuestros resultados sugieren la importancia de estudiar la integridad del contenido genético del espermatozoide.

Al estudiar la posible relación existente entre los principales parámetros del seminograma y la fragmentación del ADN, hemos observado que existe una relación estrecha entre la alteración de la movilidad y el daño en el contenido genético, tal y como observaron distintos autores (Sills et al., 2004; Chen et al., 2006; Cohen-Bacrie et al., 2009; Muriel et al., 2006; Zini et al., 2001; Lin et al., 2008). Asimismo, nuestros resultados concuerdan con los trabajos citados en la literatura (Tomlinson et al. 2001; Sills et al., 2004; Chen et al., 2006; Zini et al., 2001), observando una mayor incidencia de baja concentración de espermatozoides en la población cuyo índice de fragmentación es elevado.

En cuanto a la morfología, a diferencia de otros estudios publicados en los que correlacionan fragmentación y morfología (Tomlinson et al., 2001; Sills et al., 2004; Chen et al., 2006), nuestros resultados no muestran una clara asociación con la fragmentación espermática, aunque sí una ligera tendencia a ella, lo que puede ser justificado por el tamaño muestral del estudio.

La heterogeneidad existente en la población a estudiar, así como la presencia de varias alteraciones simultáneas en los diferentes parámetros del seminograma, dificultan el establecer una relación directa y única con la fragmentación.

Por otra parte, basándonos en estudios publicados, en nuestro centro el criterio elegido para indicar la TRA apropiada para cada pareja viene determinado no sólo por los parámetros del seminograma, sino también por el índice de fragmentación. Estudios como Bungum et al. (2004) y Duran et al. (2002) nos muestran la necesidad de un cambio de indicación de IAC a FIV/ICSI en pacientes con muestras que contienen una fragmentación elevada. Además, Benchaib et al. (2007) y Bungum et al. (2004) aconsejan que en este tipo de pacientes la técnica de elección sea un ICSI, ya que han observado un aumento notable en el éxito de los resultados, no solo por poder eliminar la fragmentación de la muestra, sino porque nos permite también poder seleccionar el espermatozoide con mejor morfología, pudiendo de esta forma eliminar esta variable.

En definitiva, analizando nuestros resultados, el estudio de la fragmentación debería considerarse como un parámetro de rutina en el estudio del seminograma para poder determinar con mayor fiabilidad la TRA más adecuada a cada paciente. En nuestro trabajo, 17 pacientes diagnosticados con un IDF >30% fueron susceptibles de cambio de técnica,  lo que nos puede ayudar a predecir de forma más personalizada cuál es el camino a seguir con cada paciente.

Son necesarios estudios prospectivos para evaluar el efecto de la fragmentación en el éxito de las TRA, así como de los procesos que la originan, con el fin de poder elegir los espermatozoides que posean el ADN íntegro y mejorar los resultados en el laboratorio.