INTRODUCCIÓN

El cultivo embrionario es un paso crítico para el correcto desarrollo del embrión, y por tanto es crucial mantener unas condiciones óptimas que permitirá seleccionar uno o dos embriones con el mejor potencial de implantación. La forma más habitual de selección embrionaria se basa en su observación a microscopio óptico durante momentos muy concretos, ya que es necesario reducir el tiempo que los embriones pasan fuera del ambiente controlado del incubador. El establecimiento de unos criterios de selección adecuados ha sido la causa responsable del incremento del éxito de la fecundación in vitro (Ajduk and Zernicka-Goetz, 2012), además, esta evaluación embrionaria convencional es el indicador general de calidad en la mayoría de los laboratorios de reproducción (Neuber et al., 2006; Kupka et al., 2014). Sin embargo, no es un reflejo del desarrollo dinámico de los mismos, por lo que no es representativo del desarrollo global del embrión (Cruz et al., 2011).

El desarrollo tecnológico está permitiendo que muchas prácticas en los laboratorios de reproducción asistida se estén automatizando, entre ellas, está el nuevo sistema de cultivo embrionario a través de sistemas time-lapse (STL) que permite la evaluación del desarrollo embrionario dentro del incubador, con la ventaja de que evita someter a los embriones a cambios de temperatura y pH. No obstante, las exposiciones prolongadas de luz pueden ejercer un efecto adverso en su desarrollo y calidad (Oh et al., 2007). A diferencia de lo que ocurre con la microscopía estándar, esta herramienta permite una observación continua del desarrollo embrionario con una evaluación detallada de los eventos que forman parte del desarrollo preimplantatorio. Por otra parte, nos permite detectar eventos anormales en la división que con el cultivo convencional no se observan como: divisiones asimétricas, formación y reabsorción de fragmentos, aparición y desaparición de multinucleación, divisiones directas de una a tres células, etc.

La correlación entre la morfología y la viabilidad embrionaria está bien documentada a través de múltiples estudios que lo respaldan (Finn et al., 2010; Meseguer et al., 2012). Sin embargo, estas tasas continúan siendo relativamente bajas, con una tasa de embarazo clínico alrededor del 30%. La principal cuestión, es si los STL podrán aportar un mayor conocimiento que permita aumentar estas tasas de embarazo. Hasta la fecha, se han creado dos corrientes a la hora de evaluar la validez de los STL, una de ellas, es si mejora la evolución embrionaria y por tanto la tasa de embarazo y la otra, si la evolución citocinética aporta nuevos parámetros a la hora mejorar de seleccionar embriones para conseguir un mayor éxito reproductivo. Algunos grupos han obtenido en sus estudios información muy valiosa que ha permitido proponer algoritmos para predecir la viabilidad del embrión (Wong et al., 2010; Meseguer et al., 2011; Campbell et al., 2013; Basile et al., 2014). Además, diversos trabajos defienden que la tasa de embarazo se ve favorecida con el uso de estos sistemas (Meseguer et al., 2012; Rubio et al., 2014), sin embargo, otros autores defienden que no existen diferencias (Cruz et al., 2011; Kirkegaard et al., 2012; Park et al., 2015). Por otro lado, otros autores defienden que la tasa de aborto es mayor en embriones seleccionados a través de time lapse (Park et al., 2015). Una posible explicación, es que la selección a través de criterios convencionales es más difícil a través del sistema de imagen que proporciona esta tecnología. Existe por tanto, un dilema sobre el beneficio de estos STL, por lo que es importante encontrar un equilibrio entre la necesidad de evaluar el desarrollo embrionario y la necesidad de limitar la manipulación, evitando la exposición a condiciones subóptimas.

Debido a que no todos los laboratorios de reproducción asistida han podido implantar esta tecnología a su rutina de trabajo, vemos necesaria una aproximación de las dos corrientes de selección embrionaria. En nuestro trabajo hemos querido comprobar, qué parámetros cinéticos se corresponden con embriones de buena calidad morfológica convencional, y cómo influyen a la morfología embrionaria los procesos de división anómalos que se escapan con la microscopía convencional.

OBJETIVOS

1. Análisis de las divisiones embrionarias a través de un sistema time-lapse con primovision.
2. Relación de los ritmos de división y de los eventos aberrantes en la división embrionaria con la calidad morfológica convencional.
3. Relación de los embriones con embarazo positivo con la calidad morfológica convencional y los ritmos citocinéticos de división.

MATERIAL Y METODOS

Se trata de un estudio prospectivo basado en el análisis de 107 embriones procedentes de 20 parejas, entre Septiembre de 2015 y Marzo de 2016. Los ovocitos fueron fecundados a través de inyección intracitoplasmática (ICSI) en parejas con factor masculino, o por fecundación in vitro convencional (FIV) en aquellas con factor femenino o esterilidad de origen desconocido (EOD). Los criterios de exclusión fueron mujeres mayores de 38 años.

Cultivo y evaluación embrionaria

Tras la microinyección de los ovocitos en estadio de metafase II se trasladaron a la placa de cultivo especial para Primovision, que albergan un máximo de 9 pocillos, por lo que aquellos pacientes con más de 9 ovocitos microinyectados fueron excluidos del estudio. El medio de cultivo utilizado fue G1 Plus (Vitrolife, serie G5). Los cúmulos ovocitarios destinados a FIV se incluyeron en placas con medio IVF Plus (Vitrolife, serie G5) y Ovoil (Vitrolife), con una concentración de 50.000 espermatozoides por ovocito, a las 18-20 horas se evaluó su fecundación. Los ovocitos fecundados se trasladaron a la placa de cultivo Primovision con G1 Plus (Vitrolife, serie G5).

Los embriones fueron evaluados de dos formas, atendiendo a criterios citocinéticos y morfológicos, cada una de ellas por un embriologo diferente.

Evaluación de la cinética embrionaria

Los ovocitos fecundados fueron analizados a través del STL con Primovision. Se evaluaron diferentes tiempos: tiempo de extrusión del segundo corpúsculo polar, (T2CP), tiempo de aparición de los pronúcleos (T2PN), tiempo de desaparición de los dos pronúcleos (TdPN), tiempo de dos blastómeras (T2), tiempo de tres blastómeras (T3), tiempo de cuatro blastómeras (T4), tiempo de cinco blastómeras (T5), tiempo de seis blastómeras (T6), duración de la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta citocinesis (Durc1, Durc2, Durc3, Durc4, Durc5), intervalo de tiempo del paso de dos a tres blastómeras (T2-3), de tres a cuatro blastómeras (T3-4), de cuatro a cinco blastómeras (T4-5) y  de cinco a seis blastómeras (T5-6).

Además, se anotaron las divisiones anómalas de 1 a 3 blastómeras (Div3), multinucleación y redistribución celular (que incluye intentos de división en los que se invagina la membrana, pero no finaliza la citocinesis y fusión de dos o más células).

Evaluación morfológica

Se evaluaron los embriones morfológicamente siguiendo las recomendaciones de la nueva clasificación de ASEBIR. La observación del estado embrionario se llevó a cabo a través de la visualización en el modo in vivo que proporciona el sistema Primovision, sin ser sacados en ningún momento de la incubadora. Se evaluó la fecundación a las 19 horas de realizar la ICSI/FIV, a las 44 se evaluó el día dos (D+2) y a las 68 horas el día tres (D+3). La catalogación embrionaria fue A y B (buena calidad), C (calidad regular) y D (mala calidad). Los embriones que se bloquearon o degeneraron fueron incluidos en la categoría E.

Transferencia embrionaria y resultados clínicos

La transferencia embrionaria se realizó en el día 3 siguiendo los criterios morfológicos convencionales. En los casos en la calidad fue similar, la evolución citocinética sirvió de apoyo para seleccionar los embriones a transferir. En todos los casos se transfirieron 2 embriones. Se consideró embarazo positivo cuando la beta-hCG fue mayor de 60 mU/ml a los 14 días de la transferencia.

Análisis estadístico

Se realizó el test Chi cuadrado para la comparación entre grupos con variables cualitativas y para las variables continuas el test t de Student, asumiendo un nivel de confianza del 95% (error alfa < 0.05), tras comprobar la normalidad con el test de Kolmogorof Smirnov con nivel de significación p>0.05.

Distribuimos las diferentes calidades morfológicas en distintos intervalos de tiempo. Los tiempos analizados fueron convertidos de variables continuas a variables categóricas, dividiéndolos en grupos basados en sus cuartiles, así, en cada cuartil se obtuvo un intervalo de tiempo en el que se distribuyeron el mismo número de embriones. A continuación, se eligieron los dos cuartiles en el que los embriones de buena calidad A superaban el 50%. Adicionalmente, se creó una variable binaria definida con el valor dentro, para aquellos embriones dentro del intervalo compuesto por los dos cuartiles de mayor número de embriones de buena calidad A, y el valor fuera, para aquellos que se encontraban dentro de este intervalo. Una vez obtenidos los dos grupos, se comprobó la frecuencia de las diferentes categorías embrionarias A/B, C o D/E en los dos grupos dentro y fuera. Para ver si las diferencias fueron significativas, se compararon a través del test Chi-cuadrado de Pearson, asumiendo un nivel de confianza del 95% (error alfa < 0.05).

Todo el análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 17.0

RESULTADOS

La media de edad fue de 34.11 años (±3.2). La tasa de embarazo por ciclo iniciado fue 20%. Entre los embriones fecundados por FIV e ICSI no existieron diferencias significativas en los tiempos analizados, a excepción del TdPN que en FIV fue mayor (27.8 horas) que en ICSI (25.6 horas) p= 0.015.

La media de los tiempos analizados por STL, según las diferentes calidades embrionarias a nivel morfológico según ASEBIR, se expresa en la Tabla I:

Los intervalos óptimos de tiempo más relevantes, que proporcionan una clara asociación entre los ritmos de división y la morfología embrionaria, fueron los estadios celulares T4 entre las 33.41-41.13 horas, T5 entre las 45.40-56.33 horas y los intervalos de tiempo entre T2-3 entre las 9.91-12.25 horas, T3-4 entre las 0-1.14 horas, T4-5 entre las 11.39-16.08 horas y T5-6 entre las 0-1.80 horas (Figura 1). En T6 entre las 48.53-54.80 no se observó dicha relación, ya que al agrupar los embriones de buena calidad (A+B) se observó un mayor porcentaje de éstos fuera del intervalo.

En cuanto a los embriones transferidos, un 66% fueron embriones de buena calidad (A+B), un 28.1% de calidad regular (C) y un 6.25% de mala calidad (D). De ellos, los que finalmente resultaron con un embarazo positivo fueron, un 87.5% de buena calidad y un 12.5% de calidad regular. Seguidamente comprobamos, si estos embriones transferidos que habían dado embarazo estaban dentro de los intervalos óptimos de buena calidad embrionaria más relevantes expuestos anteriormente. Especialmente en el tiempo de 2 a 3 células (33.46-41.13 horas) y de 4 a 5 células (11.39-16.8 horas) el 100% de los embriones estaban dentro de dicho intervalo (Figura2).

Por otro lado, analizamos la relación de aquellos embriones con comportamientos aberrantes como; la división directa de una a tres células, multinucleación y redistribución celular (intentos de división, fusión celular…), con la calidad embrionaria morfológica convencional. Los embriones con división directa de una a tres células en alguna de sus blastómeras y redistribución celular fueron estadísticamente significativos de peor calidad (Figura 3). Solo un 10% de aquellos que tuvieron división a tres células y un 13.6% de los que tuvieron redistribución celular fueron de buena calidad. Entre el 0,9% y el 6% de los embriones con división directa a 3 están dentro de los intervalos de tiempo óptimos de buena calidad embrionaria anteriormente analizados.

DISCUSIÓN

Una de las principales ventajas, tras la aparición de los sistemas time-lapse, es que evitamos la exposición de los embriones a condiciones subóptimas de temperatura y pH, por lo que la principal hipótesis es que mejora la evolución embrionaria y por tanto el potencial implantatorio. Sin embargo, en nuestro trabajo la tasa de embarazo (20%) sufrió una disminución con respecto al resto de ciclos con embriones cultivados de manera convencional (38.57%). Esto podría explicarse, debido a que una de las principales limitaciones que tienen estos STL es la imposibilidad de girar el embrión durante su evaluación, ya que debido a su aspecto tridimensional, algunas estructuras y/o características requieren de otro plano para su mejor visualización (Kaser and Racowsky, 2014), y por tanto, se podrían haber escapado características de mal pronóstico como la multinucleación.

La media de los tiempos de división analizados fue significativamente menor en los embriones de buena calidad A+B que en el resto de calidades inferiores, a excepción del tiempo de T2PN, T3 y T4-5. En relación a los intervalos de tiempo, los estadios mejor definidos en cuanto a buena calidad morfológica fueron T4 y T5, y los tiempos de división entre T2-3, T3-4, T4-5 y T5-6, ya que fueron los que mayor probabilidad tienen de dar lugar a embriones de buena calidad. Cuando comparamos estos intervalos con los encontrados en la literatura, observamos similitudes con autores como Messeguer et al, que asociaron T5 en un rango óptimo de 48.8-56.6 horas, T2-3 ≤ 11.9 y T3-4 ≤0.76 (Meseguer et al., 2011). Estos autores encontraron que los embriones dentro de estos intervalos tienen al menos un 10% más de probabilidad de implantar. Otros como VerMilyea et al., también asociaron T2-3 (9.33-11.45 horas) y T3-4 (≤ 1.73horas) a una mayor probabilidad de implantación (VerMilyea et al., 2014). También coincidimos con los intervalos de tiempo de T4, T5, T2-3 y T3-4 con otras publicaciones (Cruz et al., 2011; Conaghan et al., 2013), aunque estos autores solo pudieron predecir el desarrollo a blastocisto y no encontraron relación con la capacidad de implantación.

Por otro lado, existe controversia acerca de si la división temprana, entre las 25 y 27 horas post ICSI, mejora las tasas de embarazo, ya que hay autores que lo defienden (Shoukir et al., 1997; Sakkas et al., 1998; Ciray et al., 2005) y otros que no confirman esta relación (Emiliani et al., 2006; Sundstrom and Saldeen, 2008; de los Santos et al., 2014). En nuestro estudio, hemos podido comprobar que en embriones de mejor calidad (A+B) la primera citocinesis se produce entre 2 y 4 horas antes que en el resto de los embriones de peor calidad, con una media de 26.9 ± 2.7 horas, pero al analizar los intervalos de tiempo no encontramos relación entre la calidad embrionaria y la división temprana.

Otro aspecto importante a evaluar fue la sincronía celular, ya que diversos estudios citan que la falta de sincronía se asocia con una disminución en la capacidad implantatoria (Steer et al., 1992; Van Blerkom and Henry, 1992; De Placido et al., 2002; Hnida et al., 2004; Kirkegaard et al., 2012). En un embrión con divisiones sincrónicas la aparición de 2, 4 y 8 células tendrá un mínimo periodo de tiempo entre los estadios intermedios de 3, 5 y 7 células, siendo además el tamaño celular similar entre ellas. En nuestro estudio hemos evaluado la sincronía analizando los intervalos de tiempo entre T3-4, y observamos que aquellos embriones de buena calidad tardan 1.17 horas menos que los de calidad C, y 3.05 horas menos que los embriones de mala calidad D+E en pasar de 3 a 4 células. Además, en el análisis de intervalos de tiempo observamos como los embriones que tardan entre 0 y 1.14 horas en pasar de 3 a 4 células tendrán mayor probabilidad de ser embriones de buena calidad.

El tiempo de paso a los estadios intermedios de 3 y de 5 blastómeras lo hemos evaluado con los parámetros de T2-3 y T4-5. No encontramos una relación entre las calidades morfológicas y la media de tiempo que transcurre entre T4-5, sin embargo, cuando analizamos los intervalos de tiempo existe una clara asociación, ya que los embriones que pasan de 4 a 5 células entre las 11.39-16.08 horas tendrán un 18% más de probabilidad de tener calidad A+B que tener calidad D+E. El hecho de que la media de T4-5 no fuera significativa puede ser debido a la alta desviación estándar de las medias, por tanto, se podría deducir que la calidad embrionaria depende de un intervalo determinado de tiempo más amplio en T4-5, que cuando es diferente implica una peor calidad embrionaria.

En relación con los comportamientos aberrantes durante la división, algunos autores indican que aproximadamente el 1% de los embriones que presentan alguna anomalía logran implantarse (Hlinka et al., 2012; Rubio et al., 2014). En nuestro trabajo observamos que los embriones con división a tres células y con redistribución celular son de peor calidad, ya que solo un 10% y un 13.6% de ellos respectivamente, consiguen ser de calidad A o B. Además, un escaso porcentaje de ellos se dividió dentro de los tiempos establecidos como predictores de buena calidad.

Teniendo en cuenta, que de los embriones transferidos que dieron embarazo, el 87,5% de ellos eran de buena calidad A o B y que el mayor porcentaje de éstos se dividieron dentro de nuestros intervalos óptimos de buena calidad, que al mismo tiempo, otros autores han asociado a una mayor implantación, podemos concluir una vez más la clara relación entre la buena calidad morfológica y la probabilidad de implantación. También, podemos concluir que en ausencia de un STL, siempre que se transfieran embriones de buena calidad A o B, con una alta probabilidad no se transferirán embriones de estas características asociadas a un bajo potencial implantatorio como; división de una a tres células, fusión celular o intentos de división fallidos.

A pesar de ello, existen pocos datos que indiquen una clara efectividad del uso del time-lapse con respecto a la capacidad implantatoria (Kaser and Racowsky, 2014), por lo que es necesario avanzar en la investigación de la citocinética embrionaria para poder afianzar que parámetros proporcionan la mejor información en cuanto al potencial de implantación, de ahí, que la evaluación morfológica convencional siga siendo el Gold standard en la catalogación embrionaria.