INTRODUCCIÓN

La controversia acerca de la FIV de co-incubación corta

La técnica de Fecundación In Vitro (FIV) facilita el contacto directo de miles de espermatozoides capacitados con el oocito en un volumen y un tiempo determinados (16-18h) (Elder & Dale, 2011). De este modo, se eliminan las barreras que en condiciones naturales reducen el número espermatozoides que logra llegar al sitio de fecundación en el ámpula (Trounson, 1994).

Aunque la larga duración de la co-incubación (16-18h) en FIV fue originalmente establecida por motivos prácticos –corresponde con el momento de evaluar la aparición de los pronúcleos, desde 1990 se empezaron a desarrollar protocolos de corta duración (Huang et al., 2013). Y fue gracias a Gianaroli y su equipo, que sugirieron en 1996 que la interacción espermatozoide-oocito ocurre en 1 hora (Gianaroli et al., 1996).

Así, la breve co-incubación de los gametos durante 1 hora antes del lavado del oocito y su paso a medio de cultivo fresco sería suficiente para permitir la fecundación (Quinn et al., 1998). De hecho, aunque en 1 hora el espermatozoide no se hubiera fusionado con la membrana del oocito, sí le habría dado tiempo a adherirse a las células de la granulosa de manera que podrá fecundar finalmente en el medio fresco (Li et al., 2016). Además, con este cambio de medio se descartaría el exceso de espermatozoides y se disminuiría la incidencia de la polispermia; más alta en aquellos oocitos expuestos 16-18h a los espermatozoides (Huang et al., 2013; Li et al., 2016). Por otro lado, se mejorarían las condiciones de cultivo dado que se evitarían los productos tóxicos del metabolismo del espermatozoide, tales como las especies reactivas del oxígeno (ROS) (Aitken, J.R. and Clarkson, J.S., 1987).

Sin embargo, existe cierto escepticismo hacia estos estudios –y en especial al inicial de Gianaroli y su equipo– debido a una supuesta falta de significancia estadística y reproducibilidad de resultados entre laboratorios (Bergh et al. 1996; Walters, 1996; Barraud-Lange et al., 2008; Lundqvist et al, 2001). Los grupos en contra muestran tasas de fecundación más bajas al reducir el tiempo de co-incubación, sin además obtener una mejora en la calidad embrionaria (Barraud-Lange et al., 2008).

Por ello, parece difícil posicionarse ante esta variación en la técnica de FIV y resulta necesario generar más evidencias para poder establecer un criterio uniforme y aplicable a todos los laboratorios.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se hizo una búsqueda bibliográfica en las bases de datos PudMed (NCBI), Scope (Elsevier), Google Académico (Google), ScienceDirect (Elsevier) y HighWire (ALPSP) usando como palabras clave: ‘short co-incubation’, ‘prolonged co-incubation ‘, ‘reduced co-incubation’, ‘extended culture’, ‘reduced culture’, ‘reduced exposition’, e ‘short insemination’ en combinación con ‘oocyte’, ‘spermatozoa’, ‘sperm’, ‘gamete’ y ‘embryo’.

La finalidad fue conocer las bases teóricas que sustentan la FIVc y la metodología usada, así como reunir y analizar las evidencias a favor y en contra de la técnica. Por ello, se establecieron los siguientes criterios de inclusión para los trabajos encontrados: estudios que mostraran tasas de fecundación, porcentaje de polispermia, tasa de calidad embrionaria, tasa de implantación, tasa de embarazo o tasa de recién nacidos resultantes de aplicar el protocolo de FIVc.

RESULTADOS

Con esta estrategia de búsqueda, se encontraron 21 estudios potencialmente relevantes. Sin embargo, se descartaron 2 que usaban modelos animales (gato y oveja) para evitar interferencias, dadas las ligeras diferencias entre los mecanismos de fecundación humana y animal. También se intentó evitar seleccionar artículos del mismo año, para evitar la superposición de datos. De tal manera que, tras filtrar los artículos según los criterios de inclusión, sólo 11 de los 21 artículos iniciales fueron seleccionados.

Los trabajos publicados hasta ahora se basaban principalmente en la tasa de fecundación (Trouson, 1994; Quinn et al., 1998; Lundqvist et al, 2001; Barraud-Lange et al., 2008; Díaz et al., 2015) e implantación (Gianaroli et al., 1996),  así como en la calidad embrionaria según morfología (Quinn et al., 1998; Lundqvist et al, 2001; Barraud-Lange et al., 2008) o la tasa de recién nacidos (Huang et al., 2013, Li et al., 2016) para medir la eficacia de la FIVc.

Mientras que la mayoría de trabajos comparaban resultados de FIV convencional vs. FIVc, hubo uno que utilizaba datos obtenidos por ICSI para testar la eficacia de la FIVc. (Menezo & Barak, 2000).

Por otro lado, cabe destacar que dos de los artículos incluidos en esta revisión fueron cartas al editor en respuesta a la publicación de Gianaroli en 1996 (Walters et al., 1996; Bergh et al., 1996).

Finalmente, se clasificaron los artículos según se posicionaban a favor o en contra de la FIVc, tal y como se muestra en la tabla I:

Tabla I. Clasificación de la bibliografía seleccionada según su posicionamiento respecto a la eficacia de la FIVc (7 de 11 a favor y 4 de 11 en contra).

	Autores y año de la publicación
Autores a favor de FIVc	Trouson, 1994; Gianaroli et al., 1996; Quinn et al., 1998; Menezo & Barak, 2000; Huang et al., 2013; Díaz et al., 2015; Li et al., 2016
Autores en contra de FIVc	Bergh et al., 1996¸ Walters et al., 1996; Lundqvist et al, 2001; Barraud-Lange et al., 2008

 

DISCUSIÓN

Tras la búsqueda bibliográfica, y una vez conocidas las bases teóricas que sustentan la FIVc, se reunieron y analizaron las evidencias tanto a favor como en contra de la técnica.

FIV de co-incubación corta

Para la obtención de datos en este tipo de estudios, se recurre a realizar ciclos mixtos a las pacientes. De manera tal que, al mismo tiempo es posible testar la técnica FIVc y asegurar la fecundación de los oocitos extraídos mediante ICSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides) (Díaz et al., 2015).

Según el protocolo de Li y su grupo, 3 o 5 horas post-aspiración folicular los oocitos se someten al protocolo de FIVc. Tras la preparación del semen, los oocitos se inseminan con 1·10⁵ espermatozoides móviles progresivos y en una gota de 1mL de medio IVF (10086; Vitrolife Sweden AB), dónde se co-incuban durante 1 horas. Seguidamente, los oocitos se retiran, se lavan cuidadosamente en medio IVF fresco y se colocan en el pocillo central de una placa con medio IVF, donde se dejan 2 horas.

18 horas después, los oocitos se denudan y se evalúa la fecundación (Li et al., 2016). No obstante, existe cierta variación entre los trabajos revisados en cuanto al momento de la decumulación. Mientras algunos autores denudan los oocitos de la FIV y FIVc a la vez (18h) (Li et al., 2016; Gianaroli et al., 1996), otros lo hacen tras el período de incubación correspondiente; FIV a las 18h y FIVc a la 1-3h (Menezo & Barak, 2000; Díaz et al., 2015). Esta diferencia se debe a una cuestión sobre la madurez del ovocito: los grupos que decumulan los ovocitos de FIVc 18h después, argumentan que así aseguran la maduración completa del gameto femenino (Li et al., 2016).

Datos

Los estudios que comparan ambos protocolos de inseminación se basan en los siguientes parámetros para valorar la eficiencia de dichas técnicas: calidad embrionaria, tasa de fecundación, porcentaje polispermia, tasa de implantación, tasa de embarazo clínico, tasa de aborto y tasa de recién nacidos. A continuación se presenta la tabla II, que fusiona datos procedentes de un estudio a favor de la FIVc y otro en contra, respectivamente:

Tabla II. Resultados a favor de la FIVc (Li et al., 2016) y en contra (Lundqvist et al, 2001), dónde los oocitos de las pacientes fueron randomizados entre los distintos grupos

	En contra de FIVc		A favor de FIVc
			Mujeres ≤ 30 (n =220)		Mujeres > 30 (n= 350)
	2h	18h	2h	18h	2h	18h
nº pacientes	26	35	102	118	179	171
Nº oocitos	488	504	–	–	–	–
Tasa de fecundación (%)	72,50	80,50	68,28	70,82	70,97	72,54
Polispermia (%)	3,00	6,00	–	–	–	–
Embriones seleccionados para transferir (%)	22,00	24,00	–	–	–	–
Embriones seleccionados para crioconservación (%)	18,00	23,00	–	–	–	–
Tasa de implantación (%)	29,00	23,00	41,90	31,25	21,80	23,79
Tasa de recién nacidos (%)	35,00	26,00	50,00	39,83	36,31	30,41

 

A favor de la FIVc

Durante el periodo de co-incubación, algunos metabolitos como las ROS, E₂ y P₄ son producidos por los espermatozoides y las células del cúmulo (Li et al., 2016). El estrés oxidativo se asocia a la peroxidación de macromoléculas como lípidos y proteínas de membrana, así como daño en el DNA. De este modo, la fluidez de la membrana celular se vería afectada y la rigidez de la membrana plasmática del oocito podría prevenir la división celular (Gianaroli et al., 1996). La incidencia de estas alteraciones, aumentada en la FIV por el largo periodo de incubación, desemboca en altos porcentajes de fragmentación y bloqueo en los embriones (Shih et al., 2014) y afecta a su viabilidad, e incluso potencialmente la epigenética de los futuros niños (Menezo & Barak, 2000).

Además, a la hora de interpretar resultados en este tipo de estudios hay que tener en cuenta los diversos factores que afectan la tasa de implantación en FIV. Uno de ellos es la edad de los oocitos; aquellos con más de 35 años han demostrado ser más sensibles a las especies ROS durante la inseminación (Thouas et al., 2005). No obstante, como puede apreciarse en la tabla II no se encuentra un aumento en la tasa de implantación en los casos de mujeres mayores sometidas a FIVc. Esto puede deberse a que las alteraciones cromosómicas ocurren en el 60-70% de los oocitos envejecidos, probablemente por el incremento del ambiente hipóxico en el líquido folicular de ovarios con edad avanzada (Van Blerkom et al., 1997). Otro factor que influye en el daño al oocito es la calidad de los espermatozoides; de manera que el esperma patológico es propenso a generar más ROS que aquel clasificado como normozoospérmico (Huang et al., 2013).

Por otro lado, algunos estudios abogan que durante la FIV convencional, los oocitos están expuestos a una concentración supra-fisiológica de espermatozoides durante más tiempo y esto aumenta las probabilidades de polispermia. Los zigotos poliespérmicos son considerados un fallo de fecundación, dado que tienen dotaciones cromosómicas anómalas y suelen resultar en abortos o fallos de implantación (Huang et al., 2013; Li et al., 2016).

En contra de la FIVc

Los argumentos en contra de la FIVc hacen referencia al efecto negativo tanto de la temprana decumulación del oocito (Huang et al., 2013) como a la insuficiencia del tiempo de co-incubación para permitir la fecundación (Barraud-Lange et al., 2008).

Otra de las críticas a los trabajos que defienden la FIVc es la falta de reproducibilidad entre estudios, el tamaño muestral no suficientemente grande y la distorsión de resultados según si se sustentan en la tasa de fecundación, la calidad embrionaria obtenida, la tasa de implantación, la tasa de embarazo o la tasa de aborto (Lundqvist et al, 2001).

En definitiva, los grupos que publican resultados negativos con la FIVc afirman que el protocolo de co-incubación de los gametos corta no tiene relevancia clínica (Barraud-Lange et al., 2008).

Una posible perspectiva morfocinética

Gracias a la implantación de la tecnología time-lapse en los incubadores, los marcadores morfocinéticos se han convertido en una nueva herramienta diagnóstica para evaluar el desarrollo embrionario (Meseguer et al., 2012).

Los incubadores que cuentan con tecnología time-lapse permiten al embriólogo el seguimiento continuo del desarrollo del embrión, tanto a nivel morfológico como cinético (tiempos de división). De este modo, es posible establecer marcadores objetivos y cuantitativos asociados con la viabilidad del embrión y su capacidad de implantación (Basile et al., 2015).

Actualmente, los estudios basados en time-lapse utilizan marcadores morfocinéticos para seleccionar embriones con potencial implantatorio (Kirkegaard et al., 2015), testar diferentes medios de cultivo (Hardarson et al., 2015), detectar multinucleación y anomalías en la división (Aguilar et al., 2016), predecir aneuploidías (Grau et al., 2015) o predecir la llegada a estado de blastocisto (Milewski et al., 2015).

Por ello, en esta revisión se propone la evaluación de la técnica FIV de co-incubación corta desde un punto de vista morfocinético. Comparando los parámetros morfocinéticos de los embriones obtenidos tras los diferentes tiempos de co-incubación (corta vs. larga), es posible establecer si finalmente la calidad embrionaria resultante es la misma o no. Además, valorando con esta metodología la FIVc sería posible profundizar en el estudio de los eventos celulares tempranos que ocurren tras la fecundación del oocito (expulsión del segundo cuerpo polar, formación de pronúcleos), que no son posibles de observar en la FIV convencional (Lemmen et al., 2008).

Asimismo, la cuantificación de ROS en el medio de fecundación permitiría generar más evidencias a favor o en contra de la técnica.

Limitaciones del estudio

Dada la naturaleza de este tipo de estudios, de cara a nuevas investigaciones hay que tener en cuenta ciertas limitaciones para subsanar la supuesta falta de credibilidad y reproducibilidad de los trabajos anteriores.

Por un lado, es conocida la tendencia a transferir dos blastocistos en las clínicas de reproducción asistida. Esto dificulta el cálculo de la tasa de implantación y reduce el tamaño muestral a aquellos casos en que el nº de embriones transferidos coincida con el número de sacos gestacionales (Meseguer et al., 2012). En definitiva, es necesaria una población inicial de pacientes y ovocitos muy grande.

Por otro lado, el éxito de la implantación y la gestación es un evento multifactorial. Es decir, no sólo depende del factor calidad embrionaria sino del factor endometrio. De este modo, muchos de los fallos de implantación o gestación son interpretados como responsabilidad del embrión, mientras puede que haya sido el endometrio el factor determinante (Weissman et al., 1999).

CONCLUSIONES

Dado el reducido número de publicaciones tratando la eficacia de la FIVc y la falta de resultados concluyentes a favor de la técnica, surge la necesidad de confirmar dichos resultados positivos con más estudios. Los datos actuales no establecen una relación causal entre los resultados clínicos y los cambios metabólicos o epigenéticos que puedan sufrir los embriones.