INTRODUCCIÓN

La valoración del desarrollo de un ciclo de fecundación in vitro empieza ya el día de la punción ovocitaria, con la determinación de la calidad de los gametos para predecir el devenir del ciclo y aumentar las probabilidades de éxito. Cada vez se desarrollan nuevos elementos para permitirnos conseguir embriones de mejor calidad y, en consecuencia, con mayor potencial implantatorio. La valoración exhaustiva de dicho potencial en los embriones obtenidos de FIV – ICSI es un tema al que dedicamos mucha atención en los laboratorios, observándolos en todos sus estadios, desde el día de la punción hasta el momento de la transferencia. En la bibliografía podemos encontrar varias características a observar, tanto en gametos como en zigotos y embriones (Senn et al., 2006; Balaban et al., 2001; Wittemer et al., 2000; Tesarik and Greco, 1999; Tesarik et al., 2000; Scott et al., 2000; Gámiz et al., 2003), que se correlacionan con la obtención de embriones de mejor calidad. Toda observación realizada es interesante pero a la vez conlleva un mayor estrés para el embrión, dado que cada determinación se acompaña de un mayor tiempo de observación y, por tanto, generalmente, de exposición fuera de los incubadores. Cada centro debería determinar qué características le permiten una mayor y mejor valoración de la calidad embrionaria en relación a sus resultados, puesto que no todos coinciden en hallar las mismas correlaciones (James et al., 2006).

En nuestro laboratorio realizamos un cultivo individualizado de los embriones, observando el patrón de pronúcleos (PN) que presentan en día 1 (Gámiz et al., 2005) (ver Figuras 1 y 2) y su evolución y calidad (según criterios ASEBIR) hasta el día de la transferencia (día 2 o día 3). Dado que, como ya se ha dicho, la determinación del patrón de pronúcleos conlleva un mayor tiempo de observación y, por tanto, de exposición de los zigotos fuera de los incubadores y, teniendo en cuenta que en otros laboratorios se observa la fecundación sin determinar el patrón pronuclear, obteniendo también muy buenos resultados, decidimos estudiar si, en nuestro centro, hallábamos una relación entre el patrón pronuclear y la calidad embrionaria, para decidir si merecía la pena seguir con la valoración de dichos patrones.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se ha realizado un estudio retrospectivo, comparando la relación entre los patrones pronucleares y la calidad embrionaria de 3424 zigotos obtenidos en 619 ciclos de FIV-ICSI, tanto propios como de recepción ovocitaria (edad media 32,0 años –edad mínima 19; edad máxima 47–, tomando la edad de la persona a quien se realiza la punción, es decir, la donante en los ciclos de recepción y la paciente en los ciclos propios) realizados en nuestro centro durante los años 2008 – 2009.

Se han excluido del estudio aquellos zigotos en los que, a pesar de observarse la presencia de 2PN, estos aparecían tenues y no quedaba bien definido qué patrón pronuclear les correspondía.

Del total de embriones, 1335 fueron observados hasta día 2 y 2089 hasta día 3.

Los patrones pronucleares de referencia se muestran en la Figura 1, agrupándose en cuatro grupos (GI, GII, GIII, GIV) y la clasificación de calidades sigue la propuesta por ASEBIR (calidades A, B, C y D).

Los ovocitos maduros fueron microinyectados o inseminados. Tras la microinyección, se pasaron a gotas de 20 microlitros de G1 plus v.5 en placas Falcon embriotestadas 60 x 15, para su cultivo individualizado. Los ovocitos inseminados se pasaron a microgotas de G1 a las 3 – 5 horas post-inseminación.

Se valoraron los pronúcleos en microscopio invertido (Nikon Eclipse TE200) a las 18h post ICSI o post inseminación. Seguidamente, los zigotos fueron cambiados a placas de G1 nuevas, manteniendo su posición de cultivo. Se observó su desarrollo hasta día 2 o día 3, anotando las características de cada embrión (número de células, grado de simetría entre ellas, porcentaje de fragmentos, presencia de multinucleación) para poder clasificarlos según la calidad ASEBIR correspondiente (A, B, C o D).

Para estudiar si se hallaba relación entre la observación de un patrón pronuclear determinado y la calidad ASEBIR, se construyeron tablas de contingencia tanto para día 2 como para día 3, y se aplicó un test chi-cuadrado (mediante el paquete estadístico SPSS v. 17.0).

RESULTADOS

La frecuencia general de patrones pronucleares observados en nuestro laboratorio es la siguiente: 28,2% GI; 42,1% GII; 6,0% GIII; 23,8% GIV.

En embriones cultivados hasta día 2, la distribución general de frecuencias de calidades observadas fue la siguiente: 39,1% calidad A; 20,6% calidad B; 19,6% calidad C; 20,6% calidad D. Para día 3, la distribución general observada fue: 31,1% calidad A; 14,1% calidad B; 16,8% calidad C; 38,0% calidad D.

Si no hubiera correlación entre el patrón pronuclear observado en día 1 y la calidad embrionaria durante el cultivo (día 2, día 3), sería de esperar una distribución similar de las frecuencias anteriores cuando se analizara la calidad embrionaria a partir de cada grupo de patrones por separado. Para comprobar si la relación existía se estudiaron las tablas de contingencia para patrón pronuclear vs calidad ASEBIR, las cuales mostraron significación estadística en ambos casos (ver Tablas I y II). Así pues, en nuestro caso, hallamos una relación entre la calidad embrionaria obtenida y el patrón pronuclear.

Del estudio más detallado de las tablas se observa, en los embriones procedentes de zigotos GIII, una tendencia al aumento de la calidad C (27,5% vs. el 19,6% general) en detrimento de la calidad A (27,9% vs. el 39,1% general) para día 2.

Por otro lado, para día 3, se observa mayor proporción de embriones de calidad A (35,6% vs. el 31,1% general), así como de buena calidad (A+B) (52,1% vs. 45,2%), derivados del patrón pronuclear GI, en contraste con el aumento de calidades D derivadas del patrón GIII (47,1% vs. 38,0% general).

De los cuatro grupos de patrones pronucleares, éstos dos son los que muestran una mayor desviación respecto a los valores generales.

DISCUSIÓN

La observación del patrón pronuclear en estadio de zigoto se ha propuesto en varios estudios previos como una de las características predictivas del desarrollo embrionario y de la capacidad implantatoria (Senn et al., 2006; Balaban et al., 2001; Wittemer et al., 2000, Tesarik and Greco, 1999; Tesarik et al., 2000; Scott et al., 2000; Gámiz et al., 2003), a pesar de que no siempre se haya hallado dicha relación (James et al., 2006).

En nuestro centro, los grupos de patrones pronucleares utilizados para clasificar los zigotos nos permiten predecir de manera significativa una distribución distinta de la calidad del embrión celular (día 2, día 3), especialmente en los que derivan de patrones GI (mayor tasa de desarrollo de embriones de calidad óptima) y GIII (mayor probabilidad de desarrollo embrionario de calidad D).

Dado que la valoración del patrón pronuclear en nuestro laboratorio se realiza simultáneamente a la valoración de la fecundación (observación del número de PN y de CP a las 18h postinseminación o ICSI), y por ello no supone un aumento significativo del tiempo de exposición del embrión fuera del incubador, y, ya que nos permite establecer un pronóstico del desarrollo, sobre todo en el caso de los grupos GI y GIII, consideramos interesante seguir manteniendo este criterio de valoración como otro de los utilizados en la elección de los mejores embriones para transferir.

A pesar de todo, y a diferencia de otros estudios publicados, no se ha valorado la capacidad implantatoria de los embriones derivados de cada grupo de patrones pronucleares, por tratarse de un estudio retrospectivo en el que, a la hora de transferir, no se utilizó el patrón pronuclear como criterio de selección. Un estudio más detallado y dirigido a la predicción de la capacidad implantatoria de un embrión a partir del patrón pronuclear observado sería necesario en nuestro caso.

Otra conclusión que se desprende de la observación de los resultados en el análisis realizado, es que en día 2 se observa mayor porcentaje de embriones de buena calidad (A+B) que en día 3. Esto se debe sobre todo a que, en los casos de transferencias en día 2, los mejores embriones se seleccionan ya sea para transferir, ya sea para su criopreservación, pero no siguen el cultivo hasta día 3. De todos modos, hay otro grupo nada menospreciable de embriones que, siendo de calidad óptima en día 2, no dividen o lo hacen en un grado muy bajo (sólo una división) entre día 2 y día 3, pasando a calidad D. Es posible que esto sea consecuencia de una mala activación del genoma embrionario, que empieza a manifestarse en este momento del desarrollo (en las primeras divisiones el embrión depende del material genético del ovocito). Por esta razón, nuestra elección inicial sería la de transferencia en día 3, pues nos permite seleccionar mejor los embriones.

AGRADECIMIENTOS

A todas las compañeras que han colaborado en este estudio y que, con gran esfuerzo, recopilan los datos necesarios para desarrollar proyectos como éste.

A Lluís Bassas, por su ayuda desinteresada en el tratamiento estadístico de los datos.