Introducción

Una de las técnicas complementarias en reproducción asistida es la criopreservación, que hace posible almacenar los gametos y preembriones con el objetivo principal de mantener su viabilidad y funcionalidad.

La congelación convencional provoca un importante daño físico-químico en las estructuras intracelulares, incluyendo: aumento de la peroxidación lipídica de la membrana, descenso de la velocidad, motilidad, morfología, viabilidad y actividad mitocondrial e inducción de varios procesos asociados a la muerte celular (O´Conell et al., 2002). Para eliminar la formación de cristales de hielo, los crioprotectores permeables (glicerol, propilenglicol, etilenglicol o dimetilsulfóxido) se utilizan en la criopreservación celular. No obstante, éstos pueden inducir estrés letal debido a la formación de cristales de hielo, lo que se conoce como “efecto soluto”, y repercusiones genéticas inherentes a la toxicidad química (Gilmore et al., 1997).

La primera referencia a la vitrificación de espermatozoides data de 1938 (Luyet & Hoddap, 1938) con unos resultados de muy baja o nula supervivencia, ya que las velocidades críticas de enfriamiento eran imposibles de conseguir. La reducción del uso tanto de crioprotectores permeables como no permeables se sugirió como alternativa (Nawroth et al., 2002) debido a la baja tolerancia de estas células a las elevadas concentraciones de los crioprotectores permeables citotóxicos (Gilmore et al., 1997; Isachenko et al., 2003), y posteriormente se propusieron cuatro técnicas diferentes de vitrificación espermática (Isachenko et al., 2005). Tras esto, la vitrificación tuvo éxito al sumergir directamente la dilución espermática en nitrógeno líquido (LN₂) con bajas concentraciones de crioprotectores no permeables (Isachenko et al., 2008; Sánchez et al., 2012).

La vitrificación preserva adecuadamente la funcionalidad espermática con una alta motilidad, baja criocapacitación, elevado potencial de membrana mitocondrial, baja fragmentación de ADN, conservación acrosómica y elevada integridad de membrana en comparación a la congelación convencional (Isachenko et al., 2012a), además de ofrecer la ventaja de proteger al espermatozoide de las lesiones inherentes a la criopreservación (Meseguer et al., 2004) y, en particular, de los efectos mutagénicos de los crioprotectores permeables (Fraga et al., 1991). Este método, basado en la congelación ultra rápida (2000ºC min^-1), permite que el agua pase a un estado vítreo por un incremento extremo de la viscosidad donde la solidificación ocurre a bajas temperaturas sin la formación de cristales y sin la necesidad de añadir plasma seminal o crioprotectores permeables. Dado que el espermatozoide contiene gran cantidad de proteínas, azúcares y otros componentes, la matriz intracelular, altamente viscosa y compartimentada, actúa como un crioprotector natural (Isachenko et al., 2011, 2012a). El espermatozoide, libre de plasma seminal y con función conservada puede ser utilizado de inmediato tras la descongelación para cualquier técnica de medicina reproductiva, en volúmenes pequeños (1-5 µL) para fecundación in vitro convencional e inyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI) (Isachenko et al., 2012b), o en volúmenes mayores para inseminación intrauterina (IUI) (100-500 µL) (Isachenko et al., 2011). Este nuevo método otorga a pacientes oligoastenozoospérmicos severos una alternativa terapéutica de bajo coste, previo a las técnicas de fecundación in vitro, ya que permite almacenar espermatozoides seleccionados hasta obtener la concentración adecuada mediante acumulación de pajuelas (Figura 5) para realizar ciclos de IUI (Sánchez et al., 2012).

Material y métodos

La búsqueda de esta revisión bibliográfica se ha realizado mediante la base de datos Pubmed, las revistas Fertility & Sterility y Human Reproduction, así como Google académico, con artículos comprendidos entre los diez últimos años, de 2006 a 2016. Las palabras clave usadas en la búsqueda bibliográfica son las siguientes: vitrificación, congelación, criopreservación, espermatozoide, nitrógeno, parámetros espermáticos.

Parámetros espermáticos

Motilidad

La motilidad de los espermatozoides, evaluada mediante cámara Makler y microscopio a 20x aumentos, criopreservados en un volumen de 10 µL y en ausencia de crioprotectores permeables, mostró diferencias significativas al comparar la vitrificación vs. congelación convencional (28.0±6.0% vs. 18.0±9.2% respectivamente, p<0.05; en fresco 35.0±7.5%). También se observaron diferencias estadísticamente significativas a las 24 h (12.0±2.8% vs. 5.0±3.1% respectivamente, p<0.05; en fresco 20.0±3.9%) y a las 48 h (6.0±1.0% vs. 0.5±0.02% respectivamente, p<0.1; en fresco 10.0±1.9%) (Isachenko et al., 2012a). Se ha descrito la vitrificación de espermatozoides en diferentes soportes (cryoloops, droplets y pajuela abierta). Dependiendo del método seleccionado, se han registrado porcentajes de motilidad de hasta el 60% en pacientes normozoospérmicos y hasta el 20% en oligoastenoteratozoospérmicos (Nawroth et al., 2002; Isachenko et al., 2004a, b, 2005, 2008).

Integridad de la membrana plasmática y viabilidad

Se observó que los valores más elevados de integridad de membrana plasmática, evaluada mediante el kit de viabilidad espermática LIVE/DEAD (Molecular Probes L-7011, Eugene, Oregon), correspondían a los espermatozoides vitrificados en comparación a la congelación convencional (56.0±5.1% vs. 22.0±3.5% respectivamente, p<0.05). No obstante, la disminución de viabilidad espermática en ambos casos fue significativa (en fresco 96.0±0.6%, p<0.05) (Isachenko et al., 2012a). En un estudio sobre ciclos en los que se emplearon espermatozoides obtenidos a partir de congelación convencional, vitrificación o muestras en fresco, se evaluaron tres parámetros embrionarios: tasa de fecundación (formación de pronúcleos), formación de preembriones (4-6 blastómeros) y llegada a estadio de blastocisto, sin observarse diferencias estadísticamente significativas (p<0.01) (Isachenko et al., 2004b).

Integridad de la membrana acrosómica

El efecto de ambos procedimientos de crioconservación sobre el estado de la membrana acrosómica se evaluó mediante tinción CTC-Hoechst 33258, observando diferencias significativas entre vitrificación y congelación convencional (55.0±5.8% vs. 21.0±3.8% respectivamente, p<0.05; en fresco 84.0±3.1%, p<0.05) (Isachenko et al., 2012a)

Criocapacitación

La criocapacitación son cambios de membrana evaluables mediante tinción con clorotetraciclina (CTC) similares a la capacitación y asociados a la crioconservación. Aunque produce variaciones en las vías de señalización intracelular del espermatozoide, es importante enfatizar que el término se refiere únicamente a los cambios a nivel funcional, no molecular (Cormier and Bailey, 2003). La vitrificación ofrece un significativo efecto de prevención a la criocapacitación en comparación a la congelación convencional (8.0±1.1% vs. 9.0±2.2% respectivamente, p<0.01; en fresco 2.0±0.3%, p<0.05). Además, la exposición a bajas temperaturas puede afectar a los mecanismos de señalización que no pueden ser medidos mediante CTC. Son necesarios más estudios con técnicas adicionales más avanzadas para investigar la inducción de cambios más complejos: determinación de vías de señalización, cambios en la estructura lipídica de la membrana, vías reguladas por kinasa/fosfatasa o una combinación de procesos (Isachenko et al., 2012a).

Potencial de membrana mitocondrial y fragmentación de ADN

No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la integridad del ADN en relación con el método de congelación (p>0,5), empleando CometAssay Reagent Kit for Single Cell Gel Electrophoresis Assay (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD). Los porcentajes de los espermatozoides que muestran ADN sin daños fueron 85,09 y 89,51 %, respectivamente, para el esperma fresco tratado o no tratado con el crioprotector, 84,62 y 83,53 % respectivamente, para el esperma congelado con o sin crioprotector, y 87,24 y 84,66 % respectivamente, para el esperma vitrificado con o sin crioprotector. (Isachenko et al., 2004a). Se analizó el potencial de membrana mitocondrial mediante MitoTracker Red CMXRosy (Invitrogen, Eugene, OR, USA) y la fragmentación del ADN mediante APO-DIRECT kit (BD Pharmungen, Franklin Lakes, USA), y se obtuvieron resultados estadísticamente significativos a favor de la vitrificación vs. congelación convencional: mayor potencial de membrana mitocondrial (11.98±4.33% vs. 6.58±1.03% respectivamente, p<0.001) y menor porcentaje de fragmentación de DNA (2.79±1.02% vs. 3.86±1.38% respectivamente, p<0.01) (Slabbert et al., 2014).

Medios de vitrificación

Crioprotectores permeables

Se ha evaluado el uso de suplementos de azúcares en la inmersión directa en LN₂: el monosacárido glucosa, el disacárido sacarosa y el trisacárido rafinosa (Koshimoto & Mazur, 2002). Este equipo llegó a la conclusión de que el efecto protector no depende tanto del tipo de azúcar empleado, sino de la concentración molar empleada. Otro grupo analizó la contribución de la glucosa, la sacarosa y la trehalosa como agentes crioprotectores y se obtuvieron los mejores resultados con 0.25 M de sacarosa en HTF (human tubular fluid medium) (Isachenko et al., 2008), con un significativo efecto crioprotector en la motilidad (Figura 1) y la integridad de la membrana mitocondrial (Figura 2). En un estudio de vitrificación mediante Cryotop (empleando el protocolo de Endo et al., 2012a,b) se obtuvieron resultados a favor de no añadir sacarosa. No obstante, en relación a otros estudios anteriores (Isachenko et al., 2004a,b), la fragmentación de ADN en espermatozoides vitrificados humanos debe oscilar entre 5-10%, y en este estudio la fragmentación supera el 10%, asociado probablemente al uso del Cryotop (Chen et al., 2014).

Adición de butilhidroxitolueno (BHT) al medio de vitrificación

Se ha demostrado el potencial efecto protector del BHT, cuyo mecanismo es la inserción de este antioxidante en la membrana espermática, incrementando su fluidez y previniendo de la adhesión del VIH a los receptores celulares diana. Las concentraciones óptimas de BHT para la criopreservación mediante vitrificación de espermatozoides humanos se encuentra en un rango entre 0.5-1.0 mM, manteniendo un alto potencial de membrana, baja fragmentación de ADN y baja producción de ROS (Figura 4). No obstanbte, se requieren más estudios que investiguen el efecto del BHT en el medio de criopreservación sobre la interacción espermatozide-virus y la posibilidad de transmisión del VIH (Merino et al., 2015).

Cambios de temperatura

Temperatura de desvitrificación

Se evaluó el efecto de la temperatura de desvitrificación en la motilidad y la funcionalidad de la membrana celular mediante test HOST en espermatozoides humanos vitrificados, concluyendo que la temperatura y el tiempo empleados en la desvitrificación espermática afectan considerablemente al mantenimiento de la funcionalidad de la membrana y la motilidad del espermatozoide. A 42ºC y 5s de exposición en el proceso de desvitrificación, el espermatozoide conserva una elevada motilidad y su funcionalidad de membrana intacta (Figura 3). (Mansilla et al., 2016)

Temperatura de almacenamiento

Se analizó el efecto del almacenamiento a -86ºC en comparación a los convencionales -196ºC (bajo LN₂), y no se encontraron diferencias entre -86ºC vs. -196ºC respectivamente en: motilidad progresiva (73% vs. 77%), fragmentación de ADN (3.1% vs. 2.9%) y potencial de membrana mitocondrial (71% vs. 74%) (Sánchez et al., 2012) (Tabla I). Las principales ventajas de eliminar la necesidad de LN₂ son la reducción de costes, tiempo, espacio, esfuerzo invertido en la búsqueda de muestras y un incremento en la seguridad del propio profesional. No obstante, para un almacenamiento más prolongado, se necesitan más estudios al respecto.

Casos clínicos

La vitrificación de espermatozoides puede ser utilizada satisfactoriamente para muestras que serán utilizadas en cualquier técnica de reproducción asistida. Los primeros casos de espermatozoides desvitrificados fueron usados para ICSI y dieron lugar a embarazo normal y posterior nacimiento de un bebé sano (Isachenko et al., 2012b). Posteriormente y basándose en estudios previos (Isachenko et al, 2003, 2005, 2008, 2011b, 2012), se modificó el protocolo de vitrificación para investigar la posibilidad de éxito en muestras vitrificadas en un volumen mayor (100 µL) y se obtuvo el primer caso de nacido vivo sano mediante inseminación tras desvitrificación (Sánchez et al., 2012).

Conclusiones

Se ha establecido un protocolo cuyos resultados han sido exitosos tanto en muestras desvitrificadas destinadas a ICSI como a IUI. La vitrificación/desvitrificación de espermatozoides ofrece mejores resultados estadísticamente significativos respecto a la congelación convencional. Los estudios evaluados nos indican que esta técnica ofrece mayores porcentajes de: motilidad, integridad de membrana plasmática como indicador de viabilidad, integridad acrosómica y potencial de membrana mitocondrial. Por otra parte, presenta menor porcentaje de fragmentación del ADN y de criocapacitación, cambios funcionales de membrana similares a la capacitación asociados a la crioconservación.

En conclusión, la vitrificación es una técnica simple, rápida, coste efectiva y capaz de recuperar una alta proporción de espermatozoides móviles, así como efectiva en la protección de espermatozoides a los agentes mutagénicos de los crioprotectores permeables y los daños inherentes a la crioconservación. No obstante, además del trabajo de Isachenko et al. como principal referente de la vitrificación de espermatozoides, y del protocolo estandarizado de Sánchez et al., son necesarios más estudios que confirmen la seguridad de esta técnica.